यह प्रोटोकॉल एक ओलिक एसिड का एक नैनोपायस synthesize करने के लिए एक कुशल विधि का वर्णन करता है-प्लैटिनम (द्वितीय) संयुग्मी एक lysine के साथ स्थिर-tyrosine-फेनीलानिन (kyf) tripeptide. काइफ और संयुग्मी के स्व-असेंबली के माध्यम से हल्के सिंथेटिक शर्तों के तहत नैनोइमल्शन रूपों ।
हम एक विधि एक ओलिक एसिड से बना नैनोपायस का उत्पादन करने के लिए का वर्णन-पीटी (द्वितीय) कोर और एक lysine-tyrosine-फेनिल (kyf) कोटिंग (kyf-Pt-NE). kyf-पीटी-पूर्वोत्तर encapsulates पीटी (द्वितीय) पर 10 wt.%, १०७ ± 27 एनएम और एक नकारात्मक सतह के आरोप का एक व्यास है । kyf-Pt-NE पानी में और सीरम में स्थिर है, और जैविक रूप से सक्रिय है । kyf के लिए एक फ्लोरोफोर के विकार एक फ्लोरिसेंट नैनोपायस कि जैविक इमेजिंग के लिए उपयुक्त है के संश्लेषण की अनुमति देता है । नैनोपायस के संश्लेषण एक जलीय वातावरण में किया जाता है, और kyf-पीटी-पूर्वोत्तर रूपों के माध्यम से आत्म एक छोटी kyf पेप्टाइड और एक ओलिक एसिड की विधानसभा-प्लैटिनम (द्वितीय) संयुग्मी । स्व-असेंबली प्रक्रिया समाधान के तापमान पर निर्भर करती है, सबस्ट्रेट्स का मोलर अनुपात, और सब्सट्रेट के अतिरिक्त प्रवाह की दर । महत्वपूर्ण चरणों में संश्लेषण के दौरान इष्टतम सरगर्मी दर को बनाए रखना, आत्म-विधानसभा के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देना, और नैनोपायस को पहले से ध्यान में रखते हुए एक केन्द्रापसारक संकेंद्रक में शामिल हैं ।
हाल के वर्षों में, वहां दवा वितरण और bioimaging1,2,3,4के रूप में ऐसे जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए नैनोकणों की इंजीनियरिंग में रुचि बढ़ गया है । nanoparticle के multifunctionality आधारित प्रणालियों अक्सर एक निर्माण के भीतर कई घटकों को शामिल करने की जरूरत है । इमारत ब्लॉकों कि लिपिड या पॉलिमर पर आधारित होते हैं अक्सर उनके भौतिक रासायनिक गुणों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उनके biocompatibility और biodegradability है, जो अंततः नैनोस्ट्रक्चर1के समारोह को प्रभावित हो सकता है के रूप में अलग, 5,6. biologically व्युत्पन्न सामग्री, जैसे प्रोटीन और पेप्टाइड, लंबे समय उनके अनुक्रम लचीलापन7,8के कारण multifunctional नैनोसंरचनाओं के होनहार घटकों के रूप में पहचाना गया है. पेप्टाइड्स स्व-उच्च का आदेश दिया अणुकणिका आर्किटेक्चर पेचदार रिबन9,10, रेशेदार मचानों11,12, और कई और अधिक, इस प्रकार के निर्माण के लिए रास्ता फ़ंग बनाने में इकट्ठा बायोमोलेकुले आधारित संकर नैनोसंरचनाएं एक नीचे-अप दृष्टिकोण13का उपयोग कर ।
पेप्टाइड्स चिकित्सा और जैव प्रौद्योगिकी में अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से एंटीकेन्सर थेरेपी14 और हृदय रोगों के लिए पता लगाया गया है15 के रूप में अच्छी तरह के रूप में एंटीबायोटिक विकास के लिए16,17, चयापचय 18विकारों, और संक्रमण19। नैदानिक परीक्षणों से गुजर रहे छोटे पेप्टाइड चिकित्सा विज्ञान के एक सौ से अधिक हैं20. पेप्टाइड्स को संशोधित करने के लिए आसान कर रहे हैं और कम लागत पर synthesize करने के लिए तेजी से. इसके अलावा, वे biodegradable हैं, जो बहुत अपने जैविक और दवा आवेदन21,22की सुविधा । संरचनात्मक घटकों के रूप में पेप्टाइड्स का उपयोग नियंत्रित रिहाई के लिए उत्तरदायी, पेप्टाइड आधारित नैनोकणों और हाइड्रोजेल डिपो के इंजीनियरिंग शामिल हैं23,24,25,26 , 27, पेप्टाइड आधारित बायोसेंसर28,29,30,31, या बायो-इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों३२,३३,३४. महत्वपूर्ण बात, यहां तक कि कम पेप्टाइड्स दो या तीन एमिनो-एसिड अवशेषों कि फेनिलएलनिन शामिल करने के लिए स्वयं-असेंबली प्रक्रियाओं३५,३६,३७ मार्गदर्शन करने के लिए पाए गए थे और स्थिर इमल्शन बनाने के लिए३८ .
प्लैटिनम आधारित दवाओं, उनकी उच्च प्रभावकारिता के कारण, कई कैंसर उपचार regimens में उपयोग किया जाता है, दोनों अकेले और संयोजन में अन्य एजेंटों के साथ३९,४०. प्लैटिनम यौगिकों monogating और intrastrand या interstrand पार लिंक बनाने के द्वारा डीएनए क्षति प्रेरित । पीटी-डीएनए घावों को सेलुलर मशीनरी द्वारा पहचाना जाता है और, यदि मरम्मत नहीं किया जाता है, तो सेलुलर एपोप्टोसिस का नेतृत्व करें । सबसे महत्वपूर्ण तंत्र, जिसके द्वारा पीटी (II) कैंसर कोशिका मृत्यु में योगदान देता है, डीएनए ट्रांसक्रिप्शन४१,४२का निषेध है । हालांकि, प्लैटिनम थेरेपी का लाभ पीटी (द्वितीय) की प्रणालीगत विषाक्तता से कम हो जाता है जो गंभीर साइड इफेक्ट को ट्रिगर करता है । यह पीटी (द्वितीय)४३, जो अक्सर डीएनए तक पहुंचने प्लेटिनम की उप चिकित्सीय सांद्रता में परिणाम के नैदानिक खुराक कम होता है । एक परिणाम के रूप में, डीएनए मरंमत कि इस प्रकार के कैंसर सेल के अस्तित्व के लिए योगदान देता है और पीटी (द्वितीय) प्रतिरोध प्राप्त करने । प्लेटिनम chemo-प्रतिरोध कैंसर विरोधी चिकित्सा में एक बड़ी समस्या है और उपचार विफलता४४,४५का मुख्य कारण है ।
हम एक स्थिर नैनोसिस्टम विकसित किया है कि पीटी (द्वितीय) एजेंट encapsulates क्रम में प्रणालीगत परिसंचरण में एक परिरक्षण प्रभाव प्रदान करने के लिए और पीटी (द्वितीय) को कम करने के लिए प्रेरित साइड इफेक्ट । प्रणाली एक ओलिक एसिड पर आधारित है-पीटी (द्वितीय) कोर एक kyf tripeptide के साथ स्थिर करने के लिए एक नैनोपायस (kyf-Pt-NE)४६फार्म का । kyf के बिल्डिंग ब्लॉक-पीटी-पूर्वोत्तर, tripeptide के एमिनो एसिड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ओलिक एसिड, आम तौर पर सुरक्षित (gras) खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) के साथ स्थिति के रूप में मांयता प्राप्त है । kyf-Pt-NE एक nanopरेसिसिटेशन विधि४७का उपयोग करके तैयार किया जाता है । संक्षेप में, ओलिक एसिड-पीटी (द्वितीय) संयुग्मी एक कार्बनिक विलायक में भंग कर दिया है और फिर एक जलीय kyf समाधान के लिए बिंदुश: जोड़ा (चित्र 1) पर ३७ ° c । समाधान के लिए कई घंटे के लिए उभारा-kyf-Pt-NE के विधानसभा आत्म अनुमति है । नैनोपायस 10 केडीए केन्द्रापसारक सांद्रता में केंद्रित है और पानी के साथ तीन बार धोया जाता है । एक fluorophore के साथ kyf के रासायनिक संशोधन फ्लोरोसेंट fitc-kyf-पीटी-NE बायोमेडिकल इमेजिंग के लिए उपयुक्त के संश्लेषण की अनुमति देता है ।
nanoemulsion संश्लेषण में महत्वपूर्ण कदम substrates के मोलर अनुपात को समायोजित करने, ओलिक एसिड के दौरान तापमान और प्रवाह दर नियंत्रण को बनाए रखने-पीटी (द्वितीय) इसके अलावा, आत्म विधानसभा के लिए पर्याप्त समय प्रदान कर…
The authors have nothing to disclose.
हम आभार राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, अनुदान SC2CA206194 से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा कर रहे हैं ।
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |