Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å syntetisere et nanoemulsion av en oljesyre acids-platinum(II) konjugert stabilisert med en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) tripeptide. Nanoemulsion skjemaene under mild syntetiske forhold via selvstendig montering av KYF og finne komplekskonjugerte.
Vi beskriver en metode for å produsere en nanoemulsion består av en oljesyre acids-Pt(II) core og lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) belegg (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE omslutter Pt(II) 10 wt. %, diameteren 107 ± 27 nm og et negativt overflate. KYF-Pt-NE er stabil i vann og i serum, og er biologisk aktive. Bøyning av en fluorophore til KYF kan syntesen av et fluoreserende nanoemulsion som passer for biologiske bildebehandling. Syntese av nanoemulsion utføres i en vandig miljø og KYF-Pt-NE skjemaene via selvstendig montering av et kort KYF peptid og en oljesyre acids-platinum(II) konjugert. Den selv-montering prosess avhenger temperaturen i løsningen, molar forholdet mellom substrater og flow rate av underlaget tillegg. Avgjørende trinnene omfatter opprettholde optimal omrøring hastigheten under syntese, tillater nok tid for selvstendig montering og pre konsentrerer seg i nanoemulsion gradvis i en sentrifugal konsentrator.
I de senere årene har det vært en økende interesse i prosjekteringen av nanopartikler for slike biomedisinsk programmer som narkotika-leveranser og bioimaging1,2,3,4. Multifunksjonalitet hydrogenion-baserte systemer nødvendiggjør ofte omfatter flere komponenter i en formulering. Byggeblokkene er basert på lipider eller polymerer ofte avviker i form av mekanisk-egenskaper samt deres biocompatibility og biologisk nedbrytbarhet, som til slutt kan påvirke funksjonen til nanostructure1, 5,6. Biologisk avledede materialer som proteiner og peptider, har lenge vært anerkjent som lovende komponenter av multifunksjonelle nanostrukturer på grunn av deres sekvens fleksibilitet7,8. Peptider selv montere i svært bestilte supramolecular arkitekturer danner spiralformede bånd9,10, fibrøs stillaser11,12og mange flere, dermed banet vei til bygningen biomolecule-baserte hybrid nanostrukturer bruke en bunn opp tilnærming13.
Peptider utforsket for programmer i medisin og bioteknologi, spesielt for anticancer terapi14 og karsykdommer15 så vel som for antibiotika utvikling16,17, metabolske lidelser18, og infeksjoner19. Det er over hundre av små-peptid therapeutics gjennomgår kliniske studier20. Peptidene er lett å endre og raskt å syntetisere til lave kostnader. Dessuten, er de biologisk nedbrytbart, som sterkt forenkler deres biologiske og farmasøytiske21,22. Bruk av peptider som strukturelle komponenter inkluderer prosjektering av forståelsesfull, peptid-baserte nanopartikler og hydrogel depoter for kontrollerte slipp23,24,25,26 , 27, peptid-baserte biosensors28,29,30,31eller bio-elektroniske enheter32,33,34. Viktigst, med korte peptider med to eller tre aminosyre rester som inkluderer fenylalanin ble funnet for å lede den selvtillit forsamlingen prosesser35,36,37 og opprette stabilisert emulsjoner38 .
Platina-baserte narkotika, på grunn av deres høy effekt, brukes i mange kreft behandlingsregimer, både alene og i kombinasjon med andre agenter39,40. Platina forbindelser indusere DNA skade ved å forme monoadducts og intrastrand eller interstrand cross-links. Pt-DNA lesjonene er anerkjent av den cellulære maskineriet og, hvis ikke repareres, føre til mobilnettet apoptose. Den viktigste mekanismen, som Pt(II) bidrar til celledød, er hemming av DNA transkripsjon41,42. Men er fordelene med platina terapi redusert med systemisk toksisitet av Pt(II) som utløser alvorlige bivirkninger. Dette fører til lavere klinisk dosering av Pt(II)43, noe som ofte resulterer i sub terapeutiske konsentrasjoner av platinum nå DNA. Som en konsekvens, bidrar DNA-reparasjon som følger til celle overlevelse og anskaffe Pt(II) motstand. Platina chemo-motstand er et stort problem i anticancer terapi og Hovedårsaken til behandling feil44,45.
Vi har utviklet en stabil nanosystem som innkapsler agenten Pt(II) gir en skjerming effekt i systemisk sirkulasjon og redusere Pt II-indusert bivirkninger. Systemet er basert på en oljesyre acids-Pt(II) core stabilisert med en KYF tripeptide til en nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. Byggesteinene i KYF-Pt-NE, aminosyrer i tripeptide samt oljesyre, har generelt anerkjent som Safe (GRAS) status med Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE er utarbeidet ved hjelp av en nanoprecipitation metoden47. Kort sagt, oljesyre acids-Pt(II) konjugert oppløst i en organisk løsemiddel og deretter legges dropwise til en vandig KYF løsning (figur 1) på 37 ° C. Løsningen er rørt i flere timer slik at selv-montering av den KYF-Pt-NE. Nanoemulsion er konsentrert i 10 kDa sentrifugal konsentratorer og vasket tre ganger med vann. Kjemisk endring av KYF med en fluorophore kan syntesen av fluorescerende FITC-KYF-Pt-NE egnet for biomedisinsk bildebehandling.
Avgjørende skritt i nanoemulsion syntese inkluderer justere molar forholdet mellom substrater, opprettholde temperaturen og flyt kontroll under oljesyre acids–Pt(II) tillegg, gir tilstrekkelig tid for selvstendig montering og rense produktet ved hjelp av en sentrifugalpumper konsentrator kolonne. Disse parameterne påvirke størrelse og morfologi av KYF-Pt-NE; Dermed er det spesielt viktig å opprettholde riktig molar forholdet og justere syntetiske betingelsene riktig.
Forholdet mellom sub…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner takknemlig støtte fra National Cancer Institute, gi SC2CA206194. Ingen konkurrerende økonomiske interesser er deklarert.
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |