Este protocolo describe un método eficiente para sintetizar una nanoemulsión de un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II) estabilizado con un tripéptido de lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Las formas de nanoemulsión condiciones suaves sintético a través de autoensamblaje de lo KYF y el conjugado.
Se describe un método para producir una nanoemulsión compuesto de un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) y una capa de (KYF) de fenilalanina-tirosina-lisina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE encapsula Pt(II) en 10% en peso, tiene un diámetro de 107 ± 27 nm y una carga superficial negativa. KYF-Pt-NE es estable en agua y suero y es biológicamente activo. La conjugación de un fluoróforo a KYF permite la síntesis de una nanoemulsión fluorescente adecuado para la proyección de imagen biológica. La síntesis de la nanoemulsión se realiza en un ambiente acuoso y las formas de KYF-Pt-NE a través de uno mismo-montaje de un péptido corto de KYF y un conjugado de ácido oleico acids-platinum(II). El proceso uno mismo-Asamblea depende de la temperatura de la solución, la fracción molar de los sustratos y la tasa de flujo de la adición del sustrato. Pasos cruciales incluyen mantener el ritmo óptimo de agitación durante la síntesis, permitiendo suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y la concentración la nanoemulsión gradualmente en un concentrador centrífugo.
En los últimos años ha habido un creciente interés en la ingeniería de nanopartículas para aplicaciones biomédicas como la entrega de la droga y Bioimagen1,2,3,4. La multifuncionalidad de los sistemas basados en nanopartículas requiere a menudo incorporando múltiples componentes dentro de una formulación. Los bloques que se basan en lípidos o polímeros a menudo difieren en cuanto a sus propiedades fisicoquímicas así como su biocompatibilidad y biodegradabilidad, que podría afectar la función de la nanoestructura1, 5,6. Materiales derivados biológicamente, tales como proteínas y péptidos, durante mucho tiempo han sido reconocidos como componentes prometedores de nanoestructuras multifuncionales debido a su flexibilidad de secuencia7,8. Péptidos, uno mismo-montar en arquitecturas supramoleculares altamente ordenadas formación helicoidal cintas9,10, andamios fibroso11,12y muchos más, allanando así el camino para la construcción Nanoestructuras basados en biomoléculas híbrido utilizando un fondo enfoque13.
Péptidos se han explorado para aplicaciones en medicina y biotecnología, especialmente para la terapia contra el cáncer14 y enfermedades cardiovasculares15 así como en cuanto a desarrollo de antibiótico16,17, metabólicos trastornos18y19de las infecciones. Hay más de un centenar de pequeños péptidos terapéuticos sometidos a ensayos clínicos20. Péptidos son fáciles de modificar y a sintetizar a bajo costo. Además, son biodegradables, que facilita sus aplicaciones biológicas y farmacéuticas21,22. El uso de péptidos como componentes estructurales incluye la ingeniería de nanopartículas basada en péptidos, sensibles y depósitos de hidrogel para liberación controlada23,24,25,26 , 27, biosensores basados en péptidos28,29,30,31o dispositivos bio-electrónicos32,33,34. Lo importante, se encontraron péptidos cortos incluso con dos o tres residuos de aminoácidos que incluyen fenilalanina para guiar a la uno mismo-Asamblea35,36,37 los procesos y crear emulsiones estabilizadas38 .
Fármacos basados en platino, debido a su alta eficacia, se utilizan en muchos regimenes de tratamiento del cáncer, tanto solos como en combinación con otros agentes39,40. Compuestos de platino inducen daño en el ADN por formación de enlaces cruzados de monoadducts e intrafilamentoso o interstrand. Las lesiones de Pt-ADN son reconocidas por la maquinaria celular y, si no se repara, conducen a la apoptosis celular. El mecanismo más importante, por que Pt(II) contribuye a la muerte de la célula de cáncer, es la inhibición de DNA transcripción41,42. Sin embargo, los beneficios de la terapia de platino son disminuidos por la toxicidad sistémica de Pt(II) que provoca efectos secundarios graves. Esto conduce a baja dosificación clínicos de Pt(II)43, que a menudo resulta en concentraciones subterapéuticas de platino alcanzando el ADN. Como consecuencia, la reparación del ADN que sigue contribuye a la supervivencia de la célula de cáncer y adquisición de resistencia de Pt(II). La quimio-resistencia del platino es un problema importante en la terapia contra el cáncer y la principal causa de fracaso de tratamiento44,45.
Hemos desarrollado un estable nanosistemas que encapsula al agente Pt(II) para proporcionar un efecto protector en la circulación sistémica y a disminuir los efectos secundarios inducidos por el Pt II. El sistema se basa en un núcleo de ácido oleico acids-Pt(II) estabilizado con un tripéptido KYF para formar una nanoemulsión (KYF-Pt-NE)46. Los bloques de edificio de KYF-Pt-NE, los aminoácidos de la tripéptido así como el ácido oleico, poseen el estado generalmente reconocido como seguro (GRAS) con alimentos y drogas (FDA). KYF-Pt-NE se prepara utilizando un método de nanoprecipitation47. En Resumen, el acids-Pt(II) oleico conjugado es disuelto en un solvente orgánico y luego se agrega gota a gota a una solución acuosa de KYF (figura 1) a 37 ° C. La solución se agita durante varias horas permitir que uno mismo-Asamblea de KYF-Pt-ne La nanoemulsión está concentrada en concentradores centrífugos de 10 kDa y lavaron tres veces con agua. La modificación química de KYF con un fluoróforo permite la síntesis de FITC-KYF-Pt-NE fluorescente adecuado para la proyección de imagen biomédica.
Pasos críticos en la síntesis de nanoemulsión incluyen ajustar la relación molar de los substratos, mantener la temperatura y el flujo de control de la frecuencia durante acids–Pt(II) oleico además, proporcionando suficiente tiempo para uno mismo-Asamblea y purificar el producto usando un columna del concentrador centrífugo. Estos parámetros influyen en el tamaño y la morfología de KYF-Pt-NE; por lo tanto, es particularmente importante mantener la relación molar apropiada y ajustar correctamente las condicion…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos el apoyo financiero del Instituto Nacional del cáncer, concesión de SC2CA206194. No se declaran intereses financieros que compiten.
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |