JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

En tripeptid-stabiliserad Nanoemulsion oljesyra

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59034
, , , ,
1Department of Chemistry,Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women’s Health Research Institute,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research,Western Connecticut Health Network

Summary

Det här protokollet beskriver en effektiv metod för att syntetisera en nanoemulsion av en oljesyra acids-platinum(II) konjugat stabiliserad med en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) tripeptid. De nanoemulsion formerna under milda syntetiska förhållanden via självmontering av KYF och konjugat.

Abstract

Vi beskriver en metod för att producera en nanoemulsion som består av en oljesyra acids-Pt(II) kärna och en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) beläggning (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE kapslar in Pt(II) på 10 WT %, har en diameter på 107 ± 27 nm och en negativ ytladdning. KYF-Pt-NE är stabil i vattnet och i serum, och är biologiskt aktiva. Konjugationen av en fluorophore till KYF tillåter syntesen av en fluorescerande nanoemulsion som är lämplig för biologiska imaging. Syntesen av nanoemulsion utförs i en vattenlösning miljö och formulären KYF-Pt-NE via självmontering av en kort KYF-peptid och en oljesyra acids-platinum(II) konjugat. Den självmontering process beror på temperaturen av lösningen, molar förhållandet av substratesna, och flödet av substrat tillägg. Avgörande steg omfattar att upprätthålla optimal omrörningshastigheten under syntesen, tillåter tillräckligt med tid för självmontering och pre koncentrera nanoemulsion gradvis i en centrifugal koncentrator.

Introduction

Under de senaste åren har det funnits ett växande intresse för konstruktion av nanopartiklar för biomedicinska tillämpningar som drogen leverans och bioimaging1,2,3,4. Multifunktionellt Nanopartikel-baserade system kräver ofta innehåller flera komponenter inom en formulering. De byggstenar som är baserade på lipider eller polymerer ofta skiljer sig vad gäller deras fysikalisk-kemiska egenskaper samt deras biokompatibilitet och nedbrytbarhet, som i slutändan kan påverka funktionen av nanostruktur1, 5,6. Biologiskt material, till exempel proteiner och peptider, har länge setts som lovande komponenter av multifunktionella nanostrukturer på grund av deras sekvens flexibilitet7,8. Peptider själv montera in mycket beställda Supramolekylär arkitekturer bildar spiralformade band9,10, fibrösa ställningar11,12och många fler, därigenom bereda vägen till byggnad Biomolecule-baserade hybrid nanostrukturer med en bottom-up strategi13.

Peptider har undersökts för tillämpningar inom medicin och bioteknik, särskilt för cancer behandling14 och hjärt-kärlsjukdomar15 samt när det gäller antibiotika utveckling16,17, metabola störningar18, och infektioner19. Det finns över hundra av små-peptide therapeutics genomgår kliniska prövningar20. Peptider är lätt att ändra och snabb att syntetisera till låg kostnad. De är dessutom biologiskt nedbrytbara, vilket avsevärt underlättar deras biologiska och farmaceutiska tillämpningar21,22. Användning av peptider som strukturella komponenter omfattar konstruktion av lyhörd, peptid-baserad nanopartiklar och hydrogel depåer för kontrollerad frisättning23,24,25,26 , 27, peptid-baserad biosensorer28,29,30,31eller bio-elektroniska enheter32,33,34. Ännu viktigare, även korta peptider med två eller tre aminosyror restprodukter som innehåller fenylalanin konstaterades för att vägleda den självmontering bearbetar35,36,37 och skapa stabila emulsioner38 .

Platinabaserade läkemedel, på grund av sin höga effekt, används i många cancer behandlingsregimer, både ensamt och i kombination med andra agenter39,40. Platina föreningar inducerar DNA-skador genom att bilda monoadducts och intrastrand eller interstrand tvärbindningar. Pt-DNA lesioner är erkända av det cellulära maskineriet och, om inte repareras, leda till cellulära apoptos. Den viktigaste mekanismen, som Pt(II) bidrar till cancer celldöd, är hämning av DNA transkription41,42. Fördelarna med platina behandling minskas dock av systemisk toxicitet av Pt(II) som utlöser svåra biverkningar. Detta leder till lägre klinisk dosering av Pt(II)43, vilket ofta resulterar i sub terapeutiska koncentrationer av platina att nå DNA. Som en följd bidrar av DNA-reparation som följer till cancer cellöverlevnad och förvärva Pt(II) motstånd. Platina kemo-motståndet är ett stort problem i cancer behandling och den främsta orsaken till behandling misslyckande44,45.

Vi har utvecklat en stabil nanosystem som kapslar in Pt(II) agenten för att ge en skyddande effekt i systemcirkulationen och minska biverkningar Pt II-inducerad. Systemet bygger på en oljesyra acids-Pt(II) kärna stabiliserad med en KYF-tripeptid att bilda en nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. Byggstenarna i KYF-Pt-NE, aminosyrorna tripeptid samt oljesyrehalt, har i allmänhet som säkra ”(GRAS) status med Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE är beredd med hjälp av en nanoprecipitation metod47. Kort sagt, oljesyra acids-Pt(II) konjugatet löses i ett organiskt lösningsmedel och sedan droppvis till en KYF vattenlösning (figur 1) vid 37 ° C. Lösningen rörs i flera timmar för att tillåta självmontering av den KYF-Pt-NE. Nanoemulsion är koncentrerade till 10 kDa centrifugal koncentratorer och sköljas tre gånger med vatten. Kemisk modifiering av KYF med en fluorophore tillåter syntesen av fluorescerande FITC-KYF-Pt-NE lämplig för biomedicinsk avbildning.

Protocol

1. Sammanfattning av oljesyra Acids–Platinum(II) konjugatet Aktivering av cisplatin Upphäva 50 mg (0.167 mmol) av cisplatin i 4 mL vatten (t.ex. nanopure) vid 60 ° C. Tillsätt droppvis 55,2 mg (0.325 mmol) AgNO3 i 0,5 mL vatten till lösningen av cisplatin och rör reaktionen för minst 2 h vid 60 ° C. En vit fällning av Granulatfyllda bildar som visar förloppet för reaktionen. För att avgöra om aktiveringen reaktionen är klar, genomföra testet med 10% HCl f…

Representative Results

Representant TEM bild av KYF-Pt-NE tillagade detta protokoll visas i figur 2A. KYF-Pt-NEs är sfäriska i morfologi, väl spridda, och enhetliga i storlek. KYF-Pt-NEs, mätt direkt från tre TEM bilder med ett minimum av 200 mätningar göras, core diameter är 107 ± 27 nm. KYF-Pt-NE, analyseras med dynamisk ljus spektroskopi (DLS), hydrodynamisk diameter befanns vara 240 nm med en polydispertion index på 0,156. Zeta potential för KYF-Pt-NE i vatten bestä…

Discussion

Kritiska steg i nanoemulsion syntesen inkluderar justera molar förhållandet av substratesna, bibehållen temperatur och flöde klassar kontroll under oljesyra acids–Pt(II) tillägg, som ger tillräckligt med tid för självmontering och rening av produkten med en centrifugal koncentrator kolumn. Dessa parametrar påverkar storlek och morfologi av KYF-Pt-NE; Det är alltså särskilt viktigt att upprätthålla korrekt molar förhållandet och justera de syntetiska villkor korrekt.

Förhåll…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tacksamt erkänna finansiellt stöd från National Cancer Institute, bevilja SC2CA206194. Inga konkurrerande finansiella intressen deklareras.

Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based ‘on-off’ biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Recherche en cancérologie. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas, ., J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. . Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User’s Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

TripeptideNanoemulsionOleic AcidCisplatinPlatinumOvarian CancerPeptide ModificationDiagnosticPharmaceuticalIn-vivo StudiesFmocL-phenylalanineL-tyrosineTBTUDIPEA

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image