JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Bio-ingénierie

En Tripeptide-stabilisert Nanoemulsion av oljesyre

Published: February 27, 2019
doi:
10.3791/59034
, , , ,
1Department of Chemistry,Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry,The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women’s Health Research Institute,Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research,Western Connecticut Health Network

Summary

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å syntetisere et nanoemulsion av en oljesyre acids-platinum(II) konjugert stabilisert med en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) tripeptide. Nanoemulsion skjemaene under mild syntetiske forhold via selvstendig montering av KYF og finne komplekskonjugerte.

Abstract

Vi beskriver en metode for å produsere en nanoemulsion består av en oljesyre acids-Pt(II) core og lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) belegg (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE omslutter Pt(II) 10 wt. %, diameteren 107 ± 27 nm og et negativt overflate. KYF-Pt-NE er stabil i vann og i serum, og er biologisk aktive. Bøyning av en fluorophore til KYF kan syntesen av et fluoreserende nanoemulsion som passer for biologiske bildebehandling. Syntese av nanoemulsion utføres i en vandig miljø og KYF-Pt-NE skjemaene via selvstendig montering av et kort KYF peptid og en oljesyre acids-platinum(II) konjugert. Den selv-montering prosess avhenger temperaturen i løsningen, molar forholdet mellom substrater og flow rate av underlaget tillegg. Avgjørende trinnene omfatter opprettholde optimal omrøring hastigheten under syntese, tillater nok tid for selvstendig montering og pre konsentrerer seg i nanoemulsion gradvis i en sentrifugal konsentrator.

Introduction

I de senere årene har det vært en økende interesse i prosjekteringen av nanopartikler for slike biomedisinsk programmer som narkotika-leveranser og bioimaging1,2,3,4. Multifunksjonalitet hydrogenion-baserte systemer nødvendiggjør ofte omfatter flere komponenter i en formulering. Byggeblokkene er basert på lipider eller polymerer ofte avviker i form av mekanisk-egenskaper samt deres biocompatibility og biologisk nedbrytbarhet, som til slutt kan påvirke funksjonen til nanostructure1, 5,6. Biologisk avledede materialer som proteiner og peptider, har lenge vært anerkjent som lovende komponenter av multifunksjonelle nanostrukturer på grunn av deres sekvens fleksibilitet7,8. Peptider selv montere i svært bestilte supramolecular arkitekturer danner spiralformede bånd9,10, fibrøs stillaser11,12og mange flere, dermed banet vei til bygningen biomolecule-baserte hybrid nanostrukturer bruke en bunn opp tilnærming13.

Peptider utforsket for programmer i medisin og bioteknologi, spesielt for anticancer terapi14 og karsykdommer15 så vel som for antibiotika utvikling16,17, metabolske lidelser18, og infeksjoner19. Det er over hundre av små-peptid therapeutics gjennomgår kliniske studier20. Peptidene er lett å endre og raskt å syntetisere til lave kostnader. Dessuten, er de biologisk nedbrytbart, som sterkt forenkler deres biologiske og farmasøytiske21,22. Bruk av peptider som strukturelle komponenter inkluderer prosjektering av forståelsesfull, peptid-baserte nanopartikler og hydrogel depoter for kontrollerte slipp23,24,25,26 , 27, peptid-baserte biosensors28,29,30,31eller bio-elektroniske enheter32,33,34. Viktigst, med korte peptider med to eller tre aminosyre rester som inkluderer fenylalanin ble funnet for å lede den selvtillit forsamlingen prosesser35,36,37 og opprette stabilisert emulsjoner38 .

Platina-baserte narkotika, på grunn av deres høy effekt, brukes i mange kreft behandlingsregimer, både alene og i kombinasjon med andre agenter39,40. Platina forbindelser indusere DNA skade ved å forme monoadducts og intrastrand eller interstrand cross-links. Pt-DNA lesjonene er anerkjent av den cellulære maskineriet og, hvis ikke repareres, føre til mobilnettet apoptose. Den viktigste mekanismen, som Pt(II) bidrar til celledød, er hemming av DNA transkripsjon41,42. Men er fordelene med platina terapi redusert med systemisk toksisitet av Pt(II) som utløser alvorlige bivirkninger. Dette fører til lavere klinisk dosering av Pt(II)43, noe som ofte resulterer i sub terapeutiske konsentrasjoner av platinum nå DNA. Som en konsekvens, bidrar DNA-reparasjon som følger til celle overlevelse og anskaffe Pt(II) motstand. Platina chemo-motstand er et stort problem i anticancer terapi og Hovedårsaken til behandling feil44,45.

Vi har utviklet en stabil nanosystem som innkapsler agenten Pt(II) gir en skjerming effekt i systemisk sirkulasjon og redusere Pt II-indusert bivirkninger. Systemet er basert på en oljesyre acids-Pt(II) core stabilisert med en KYF tripeptide til en nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. Byggesteinene i KYF-Pt-NE, aminosyrer i tripeptide samt oljesyre, har generelt anerkjent som Safe (GRAS) status med Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE er utarbeidet ved hjelp av en nanoprecipitation metoden47. Kort sagt, oljesyre acids-Pt(II) konjugert oppløst i en organisk løsemiddel og deretter legges dropwise til en vandig KYF løsning (figur 1) på 37 ° C. Løsningen er rørt i flere timer slik at selv-montering av den KYF-Pt-NE. Nanoemulsion er konsentrert i 10 kDa sentrifugal konsentratorer og vasket tre ganger med vann. Kjemisk endring av KYF med en fluorophore kan syntesen av fluorescerende FITC-KYF-Pt-NE egnet for biomedisinsk bildebehandling.

Protocol

1. syntese av Oleic Acids–Platinum(II) konjugert Aktivering av cisplatin Suspendere 50 mg (0.167 mmol) cisplatin i 4 mL vann (f.eks nanopure) på 60 ° C. Legge dropwise 55.2 mg (0.325 mmol) av AgNO3 i 0,5 mL vann til løsningen av cisplatin og rør reaksjonen minst 2 h på 60 ° C. Den hvite utløse av AgCl vil danne indikerer fremdriften av reaksjonen. For å avgjøre hvis aktivisering reaksjonen er fullført, kan du utføre testen med 10% HCl etter gratis Ag+</…

Representative Results

Representant TEM bilde av KYF-Pt-NE tilberedt med denne protokollen er vist i figur 2A. KYF-Pt-ne er sfærisk i morfologi, godt spredt, og jevn i størrelse. Kjernen diameteren på KYF-Pt-ne, målt direkte fra tre TEM bilder med minimum 200 målinger gjort, er 107 ± 27 nm. Etter diameteren på KYF-Pt-NE, analysert ved hjelp av dynamiske lys spektroskopi (DLS), ble funnet for å være 240 nm med polydispersity indeks av 0.156. Zeta potensialet i KYF-Pt-NE i v…

Discussion

Avgjørende skritt i nanoemulsion syntese inkluderer justere molar forholdet mellom substrater, opprettholde temperaturen og flyt kontroll under oljesyre acids–Pt(II) tillegg, gir tilstrekkelig tid for selvstendig montering og rense produktet ved hjelp av en sentrifugalpumper konsentrator kolonne. Disse parameterne påvirke størrelse og morfologi av KYF-Pt-NE; Dermed er det spesielt viktig å opprettholde riktig molar forholdet og justere syntetiske betingelsene riktig.

Forholdet mellom sub…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi erkjenner takknemlig støtte fra National Cancer Institute, gi SC2CA206194. Ingen konkurrerende økonomiske interesser er deklarert.

Materials

2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based ‘on-off’ biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Recherche en cancérologie. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas, ., J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. . Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User’s Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

TripeptideNanoemulsionOleic AcidCisplatinPlatinumOvarian CancerPeptide ModificationDiagnosticPharmaceuticalIn-vivo StudiesFmocL-phenylalanineL-tyrosineTBTUDIPEA
check_url/fr/59034?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image