Ce protocole décrit une méthode efficace pour synthétiser une nanoémulsion d’un conjugué de la teneur en acide oléique acids-platinum(II) stabilisé avec un tripeptide lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF). Les formes nanoémulsion dans des conditions douces synthétiques par auto-assemblage de la KYF et le conjugué.
Les auteurs décrivent une méthode pour produire une nanoémulsion composée d’un noyau de acids-Pt(II) en acide oléique et d’un revêtement (KYF) de lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF-Pt-NE). La KYF-Pt-NE encapsule pt (ii) à 10 % m/m, a un diamètre de 107 ± 27 nm et une charge négative de la surface. La KYF-Pt-NE est stable dans l’eau et dans le sérum et est biologiquement active. La conjugaison d’un fluorophore à KYF permet la synthèse d’une nanoémulsion fluorescente qui convient pour l’imagerie biologique. La synthèse de la nanoémulsion s’effectue dans un environnement aqueux et les formes de KYF-Pt-NE par auto-assemblage d’un peptide KYF court et un conjugué de acids-platinum(II) en acide oléique. Le processus d’auto-assemblage dépend de la température de la solution, le rapport molaire des substrats et la vitesse d’écoulement de l’addition du substrat. Étapes cruciales incluent maintenant le taux d’agitation optimal pendant la synthèse, permettant un délai suffisant pour l’auto-assemblage et pré concentre la nanoémulsion progressivement dans un concentrateur centrifuge.
Ces dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour l’ingénierie des nanoparticules pour des applications biomédicales comme medicaments et bioimaging1,2,3,4. La multifonctionnalité des systèmes à base de nanoparticules nécessite souvent incorporant plusieurs composants dans une formulation. Les blocs de construction qui reposent souvent sur des lipides ou des polymères se distinguent par leurs propriétés physico-chimiques ainsi que leur biocompatibilité et biodégradabilité, qui finalement pourrait affecter la fonction de la nanostructure1, 5,6. Des matériaux biologiques, tels que des protéines et des peptides, ont longtemps été reconnus comme éléments prometteurs de nanostructures multifonctionnel en raison de leur séquence flexibilité7,8. Peptides s’auto-assembler en ordonnées architectures supramoléculaires formant hélicoïdale rubans9,10, échafaudages fibreuse11,12et bien d’autres encore, ouvrant ainsi la voie au renforcement des nanostructures hybrides axée sur la biomolécule utilisant un ascendant approche13.
Peptides ont été explorées pour des applications en médecine et en biotechnologie, en particulier pour la thérapie anticancéreuse14 et maladies cardiovasculaires15 aussi bien en ce qui concerne les antibiotiques développement16,17, métabolique troubles18et les infections19. Il y a plus d’une centaine de petit-peptide thérapeutique, l’objet d’essais cliniques20. Les peptides sont faciles à modifier et rapide à synthétiser à petit prix. En outre, ils sont biodégradables, ce qui facilite grandement leur applications biologiques et pharmaceutiques21,22. L’utilisation de peptides comme éléments structuraux comprend l’ingénierie des nanoparticules peptidique, rompus et des dépôts d’hydrogel pour Liberation controlee23,24,25,26 , 27, biocapteurs à base de peptides28,29,30,31ou des dispositifs bio-électroniques32,33,34. Ce qui est important, même petits peptides avec deux ou trois résidus d’acide aminé qui incluent la phénylalanine trouvées pour guider l’auto-assemblage traite35,36,37 et créer des émulsions stabilisées38 .
Médicaments à base de platine, en raison de leur grande efficacité, sont utilisés dans de nombreux régimes de traitement du cancer, aussi bien seul ou en combinaison avec d’autres agents39,40. Composés de platine induisent des lésions de l’ADN en formant des liaisons transversales des monotypes et système ou interstrand. Les lésions de l’ADN-Pt sont reconnues par la machinerie cellulaire et, si ne pas réparés, conduisent à l’apoptose cellulaire. Le plus important mécanisme, par lequel pt (ii) contribue à la mort des cellules cancéreuses, est l’inhibition de l’ADN transcription41,,42. Toutefois, les avantages de la thérapie de platine sont diminués par une toxicité systémique du PT (ii) qui déclenche des effets secondaires graves. Ceci mène à plus faible dosage clinique de PT (ii)43, qui aboutit souvent à des concentrations sous thérapeutiques du platine pour atteindre l’ADN. En conséquence, la réparation de l’ADN qui suit contribue à la survie des cellules du cancer et l’acquisition de résistance pt (ii). La chimio-résistance de platine est un problème majeur dans la thérapie anticancéreuse et la principale cause d’échec de traitement44,45.
Nous avons développé une conception stable qui encapsule l’agent pt (ii) afin de fournir un effet protecteur dans la circulation systémique et pour diminuer les effets secondaires induits par Pt II. Le système est basé sur un noyau de acids-Pt(II) en acide oléique stabilisé avec un tripeptide KYF pour former une nanoémulsion (KYF-Pt-NE)46. Les éléments constitutifs de la KYF-Pt-NE, les acides aminés de tripeptide ainsi que l’acide oléique, ont le statut de Generally Recognized As Safe (GRAS) avec la Food and Drug Administration (FDA). La KYF-Pt-N’est préparé à l’aide d’une méthode de nanoprécipitation47. En bref, le conjugué de acids-Pt(II) en acide oléique est dissous dans un solvant organique et ensuite ajouté goutte à goutte d’une solution aqueuse de KYF (Figure 1) à 37 ° C. La solution est agitée pendant plusieurs heures pour permettre à l’auto-assemblage de la la KYF-Pt-NE. La nanoémulsion est concentrée dans 10 kDa centrifuge concentrateurs et laver trois fois avec de l’eau. La modification chimique de la KYF avec un fluorophore permet la synthèse de fluorescent FITC-KYF-Pt-NE convient d’imagerie biomédicale.
Des étapes cruciales dans la synthèse de nanoémulsion incluent le rapport molaire des substrats de réglage, maintenir contrôle température et le débit de la fréquence pendant l’ajout de acids–Pt(II) en acide oléique, fournissant suffisamment de temps pour l’auto-assemblage et purifier le produit à l’aide une colonne de concentrateur centrifuge. Ces paramètres influent sur la taille et la morphologie de la KYF-Pt-NE ; ainsi, il est particulièrement important maintenir le bon rapport molaire et ajuster…
The authors have nothing to disclose.
Nous reconnaissons l’appui financier de l’Institut National du Cancer, grant SC2CA206194. Aucun intérêts financiers concurrents ne sont déclarés.
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |