JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Médecine

Avanceret billedbehandling af lunge Homing humane lymfocytter i en eksperimenterende i Vivo Model af allergisk betændelse baseret på lys-ark mikroskopi

Published: April 16, 2019
doi:
10.3791/59043
, , , , , ,
1Department of Medicine 1,University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3,University Hospital of Erlangen

Summary

Her introducerede protokollen tillader karakterisering af primære humane lymfocytter under in vivo betændelsestilstande homing lunge-kapacitet. Pulmonal infiltration af adoptively overførte human immun celler i en musemodel af allergisk betændelse kan afbildet og kvantificeres ved lys-ark Fluorescens mikroskopi af kemisk ryddet lungevæv.

Abstract

Overvældende væv akkumulering af stærkt aktiverede immunceller repræsenterer et adelsmærke for forskellige kroniske inflammatoriske sygdomme og fremstod som et attraktivt terapeutiske mål i den kliniske behandling af ramte patienter. For at optimere yderligere strategier sigter mod terapeutisk regulering af patologisk ude af balance væv infiltration af pro-inflammatoriske immunceller, vil det være af særlig betydning at opnå bedre indsigt i sygdoms – og orgel-specifikke homing egenskaber af perifere lymfocytter. Den her beskrevne eksperimentel protokol giver mulighed for at overvåge lunge ophobning af fluorescently mærket og adoptively overførte humane lymfocytter i forbindelse med papain-induceret lunge betændelse. I modsætning til standard in vitro-assays ofte anvendes til analyse af immun celle migration og chemotaxis, nu indført in vivo indstillingen tages hensyn lunge-specifikke aspekter af væv organisation og indflydelse af de komplekse inflammatoriske scenario finder sted i den levende murine organisme. Desuden tre-dimensionelle tværsnits lys-ark fluorescens mikroskopisk billeddannelse giver ikke kun kvantitative data på infiltrerer immunceller, men også skildrer mønster af immun celle lokalisering inden for den betændte lunge. Samlet set er vi kan indføre en innovativ teknik af høj værdi for immunologiske forskning vedrørende Kronisk inflammatorisk lungesygdomme, som let kan anvendes ved at følge den angivne trinvise protokol.

Introduction

Klassiske inflammatoriske sygdomme i lungerne, såsom allergisk astma og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), er kendt for at være drevet af et øget ansættelse af aktiverede lymfocytter i pulmonal væv1,2. Lymfocyt-udgivet cytokiner (fx, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ og TNF-α) yderligere fremme chemotaxis af medfødte og adaptive immunceller, fremkalde fibrotisk luftvejene remodeling eller direkte skader lungerne parenkym2. Hidtil har er de underliggende mekanismer er ansvarlige for patologisk ophobning af lymfocytter i lungevæv endnu ikke fuldt forstået. I analogi med væv-selektiv T celle prægning beskrevet for gut og hud homing, pulmonal dendritiske celler (DCs) er naturligvis stand til prime perifert T-celler til præferentiel lunge infiltration, i det mindste delvist via induktion af CCR4 udtryk på de overfladen af lymfocytter3. Udover CCR4, er luftvejs-infiltrerer T celler også kendetegnet ved en særlig øget ekspression af chemokine receptorer CCR5 og CXCR3 i forhold til T-celler i perifert blod1,4,5. Samlede, eksisterende data er i overensstemmelse med begrebet at lunge homing af T-lymfocytter fysiologiske eller inflammatoriske betingelser omfatter en række forskellige chemokine receptorer og deres respektive ligander og dermed afhænger en nøje kontrolleret samarbejde mellem medfødte og adaptive immunceller1. Især i den indledende fase af patogen eller allergen eksponering reagerer celler af den medfødte immunsystem TLR stimulation eller IgE-medieret cross-linking af øjeblikkelig løsladelse af forskellige chemoattractants, ligesom LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 og PGD21,6,7. Som et mønstereksempel, samspillet mellem PGD2 og chemoattractant receptor CRTh2 er kendt for at være af særlig betydning for chemotaxis Th2 celler og dermed syntes så lovende terapeutiske mål i den kliniske behandling af astma. Faktisk, patienter med moderat astma viste en forbedring af symptomer og en væsentlig forøgelse af den tvungen ekspirationsvolumen i ét sekund (FEV1) efter behandling med en selektiv CRTh2 antagonist sammenlignet med placebo-gruppen8 ,9. I en mere skred det inflammatoriske respons er allerede ansat T celler i stand til yderligere forstærke pulmonal lymfocyt ophobning via frigivelse af IL-4 og IL-13 som potent stimuli for pulmonal DCs. Efterfølgende er regulere disse myeloid-afledte medfødte celler op-udtryk for CCL17 og CCL22 i en STAT6-afhængige måde1,10,11.  Selv om kompleksiteten af det beskrevne scenario stadig hindrer en komplet forståelse af T celle lunge homing, tilbyder det et væld af molekylære mål for et potentielt optimeret terapeutisk kontrol af inflammatoriske eller allergisk lungesygdomme. Derfor er der et presserende behov for innovative eksperimentelle teknikker, som er i stand til yderligere at uddybe og supplere vores viden inden for T-celle chemotaxis og lunge målsøgende.

At lunge homing af lymfocytter i den menneskelige krop er påvirket af flere cellulære og humorale fysiske parametre1, er de fleste af de eksisterende eksperimentelle metoder ikke købedygtig model af denne immunologiske proces hele kompleksitet. I stedet, mange standardprotokoller til analyse af lunge homing selektivt fokusere på et specifikt aspekt, der er involveret i kaskade af lymfocyt tiltrækning, vedhæftning, migration og fastholdelse. Ud over en beskrivende bestemmelse af mRNA eller protein udtryk mønster af integriner og chemokine receptorer på perifere eller lunge-infiltrerer lymfocytter og supplerende måling af respektive chemokine niveauet i blodet, bronchoalveolar lavage (BAL) eller lunge væv12,13,14,15, veletablerede in vitro celle kultur assays tillade en funktionel karakterisering af lymfocyt vedhæftning eller chemotaxis ved defineret forsøgsbetingelser16,17,18. I princippet overvåge statiske in vitro-vedhæftning assays bindende kapacitet af kulturperler lymfocytter til en endotel éncellelag eller på glas dias belagt med rekombinant endotelial adhæsionsmolekyler (f.eks. MAdCAM-1, VCAM-1), mens standard in vitro- chemotaxis assays er normalt anvendes til at kvantificere lymfocytter evne til at overføre langs en chemokine forløb i et transwell system19. Både in vitro-indstillinger aktiverer en kontrolleret justering og graduering af forsøgsbetingelser, men på den anden side mangler vigtige variabler kendt til kritisk indvirkning på in vivo chemotaxis og vedhæftning af lymfocytter. Overvejende, statisk celle kultur assays se bort fra indflydelsen fra shear styrker forårsaget af permanent blod flow19 og forsømme potentielt inddragelse af omkringliggende immunologiske milieu og interagerende ikke-lymfocyt immunceller, begge til stede i en levende organisme. For at overvinde disse begrænsninger, fortolkning af resultaterne opnået i statisk in vitro-chemotaxis eller overholdelse af assays skal yderligere validering i dynamisk friktionskoefficient eksperimenter under flow betingelser20,21 og i i vivo modeller af inflammatoriske orgel patologi19. Faktisk vigtigt kunne drages konklusioner om regulering af T celle lunge homing inflammatoriske eller allergiske betingelser fra dyreforsøg analysere genetisk modificerede mus i definerede modeller af forskellige lungesygdomme3, 22 , 23. de kvantitative sammenligning af lunge infiltrerer lymfocytter mellem vildtype mus og mus med en mangel, for et bestemt gen af interesse udgør en veletableret og bredt anvendte redskab til at definere virkningen af særlige cellular veje eller receptorer på sygdom-drevne mønster af T celle distribution. Men i modsætning til før drøftet in vitro celle kultur assays, en undersøgelse design baseret på klassisk dyremodeller mangler evnen til at analysere og overvåge primære human T-celler direkte afledt af blod eller BAL af patienter, der lider af en inflammatorisk lunge sygdom. Således er er det stadig udfordrende at funktionelt validere om en diagnostisk angivne lungesygdom er købedygtig Kolofon humane lymfocytter til præferentiel lunge tropisme og hvor langt kliniske parametre kan have indflydelse på dette scenario. For nylig har blev en meget elegant in vivo tilgang indført i forbindelse med inflammatoriske tarmsygdomme (IBD), som var i stand til at overvinde de fleste af disse begrænsninger og åbnet nye muligheder for avanceret translationel undersøgelser på intestinal lymfocyt homing24 . Drage fordel af protokoller for opløsningsmiddel-baserede væv clearing efterfulgt af tværsnits lys-ark Fluorescens mikroskopi som et kraftfuldt værktøj til afbildning, det var muligt at visualisere infiltration og distribution af adoptively overførte human T celler i tarmen af colitic immundefekte mus24. Især denne eksperimentelle indstilling gennemført to vigtigste nyskabelser: (1) primære menneskelige immunceller kan analyseres på eksperimentelt definerede in vivo betingelser; (2) en temmelig stor område af det syge organ (ca 1,5 cm x 1,5 cm) kan være afbildet i høj opløsning kvalitet, efterfulgt af 3D-genopbygning. Desuden etableret flere nyere undersøgelser med succes brug af opløsningsmiddel-baserede væv clearing og lys-ark Fluorescens mikroskopi som vigtige værktøjer til avanceret lunge imaging25,26. For at drage fordel af dette teknologiske fremskridt inden for pulmonal immunologi, vedtog vi nu system til analyse af lunge målsøgende.

Her præsenteres protokollen giver en trinvis Introduktion hvordan til at rense og fluorescently etiket primære menneskelige T celler for overførsel ind i musene med induceret lunge betændelse, og Derudover beskriver i detaljer den efterfølgende proces med lys-ark Fluorescens mikroskopisk billeddannelse, herunder orgel forberedelse og billedbehandling. Samlet set håber vi at støtte fremtidige translationel undersøgelser inden for inflammatoriske eller allergisk lungesygdomme ved at indføre en sofistikeret, men ikke desto mindre muligt, eksperimentelle model til overvågning af menneskelige lymfocyt lunge homing på in vivo betingelser.

Protocol

Eksperimenter, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af de relevante lokale myndigheder i Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland). Mus har været opstaldet på specifikt patogenfrie betingelser. Indsamling af humant blod blev godkendt af de lokale etiske udvalg og institutionelle review board af universitetet i Erlangen-Nürnberg. Hver patient gav skriftlig informeret samtykke. 1. fremkalde allergiske lungebetændelse i mus <p …

Representative Results

Den præsenterede protokol beskriver en eksperimentel musemodel, som giver mulighed for overvågning og kvantificering af ophobning af adoptively overførte humane T lymfocytter i lunge via lys-ark Fluorescens mikroskopi. Figur 1 A giver en skematisk oversigt over de in vivo trin af den eksperimentelle tidsplan. For at garantere pålidelige resultater, er det af væsentlig betydning at sikre en god kvalitet af de isolerede og fluorescently mærket menneskelige CD4+</su…

Discussion

Den her beskrevne eksperimentelle indstilling giver mulighed for at overvåge den homing lungekapacitet primære human immun celler under in vivo betændelsestilstande og dermed relevant supplerer klassisk udføres in vitro-vedhæftning og chemotaxis assays. For at tage hensyn særlige anatomiske orgel Karakteristik af lungen, vigtige aspekter af immun celle homing (herunder chemotaxis og celle fordeling inden for målorgan) samt klinisk relevans og overførsel af erhvervede data, vi tog ford…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne parlamentsarbejdet, finansiering af DFG Collaborative Research Centre SFB 1181 og TRR 241. Optisk Imaging Center Erlangen (OICE) og i særlige Ralf Palmisano, Philipp Tripal og Tina Fraaß (projekt Z2 af DFG CRC 1181) er anerkendt for teknisk ekspertbistand til lys-ark fluorescens mikroskopisk billeddannelse.

Materials

Agarose NEEO Ultra Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45 antibody BioLegend, San Diego, USA 304060
Ammonium chloride Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany K2981
Cannula 21 G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 301300
Cell proliferation dye eflour670 eBioscience Inc., San Diego, USA 65-0840-85
CD4 MicroBeads, human Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 8043.1
Potassium-EDTA blood collection tube, 9 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 21066001
Ethly cinnamate (ECi) Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany 112372-100G
Ethanol ≥ 99.5 % (EtOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good Forte PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany P40-47500
Filter 100 µm  VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Germany 732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2 Bitplane AG, Zurich, Switzerland n.a.
ImspectorPro software Abberior Instruments GmbH, Göttingen, Germany n.a.
Ketamin  Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany 3617KET-V
LaVision UltraMicroscope II LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germany n.a.
MACS MultiStand Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-303
Multifly cannula 20 G Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 851638035
30 G needle B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9161502
Neubauer counting chamber neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany C-1003
Pattex Glue Henkel AG & Co, Düsseldorf, Germany PSK1C
LS column Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-042-401
Lymphocyte Separation Media (Density 1,077 g/ml) anprotec AC-AF-0018
RPMI medium  (Gibco) Life Technologies GmbH,
Darmstadt, Germany 61870-010
Papain Merck 1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline) Biochrom GmbH, Berlin, Germany L182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 BioLegend, San Diego, USA 317428
PerCP/Cy5.5 mouse IgG2b, κ isotype Ctrl BioLegend, San Diego, USA 400337
PFA (paraformaldehyde) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 0335.1
Potassium hydrogen carbonate Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany P7481
Serological pipette 10 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 86.1254.001 
Syringe 1 ml B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany 9166017V
Syringe 5 ml Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260067
Syringe 20 ml Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA 260069
Tube 1.5 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,706,400
Tube 2 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72.695.400 
Tube 2 ml, brown Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 72,695,001
Tube 15 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.554.502 
Tube 50 ml Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany 62.547.254 
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany 130-090-976
Xylazin (Rompun 2%) Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany KPOBD32
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: the ins and outs. Annual Review of Immunology. 26, 205-232 (2008).
  2. Baraldo, S., Lokar Oliani, K., Turato, G., Zuin, R., Saetta, M. The Role of Lymphocytes in the Pathogenesis of Asthma and COPD. Current Medicinal Chemistry. 14 (21), 2250-2256 (2007).
  3. Mikhak, Z., Strassner, J. P., Luster, A. D. Lung dendritic cells imprint T cell lung homing and promote lung immunity through the chemokine receptor CCR4. Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1855-1869 (2013).
  4. Thomas, S. Y., Banerji, A., Medoff, B. D., Lilly, C. M., Luster, A. D. Multiple chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T cell homing to the human asthmatic airway. Journal of Immunology. 179 (3), 1901-1912 (2007).
  5. Katchar, K., Eklund, A., Grunewald, J. Expression of Th1 markers by lung accumulated T cells in pulmonary sarcoidosis. Journal of Internal Medicine. 254 (6), 564-571 (2003).
  6. Wu, Z., et al. Mast cell FcepsilonRI-induced early growth response 2 regulates CC chemokine ligand 1-dependent CD4+ T cell migration. Journal of Immunology. 190 (9), 4500-4507 (2013).
  7. Hart, P. H. Regulation of the inflammatory response in asthma by mast cell products. Immunology, Cell Biology. 79 (2), 149-153 (2001).
  8. Bice, J. B., Leechawengwongs, E., Montanaro, A. Biologic targeted therapy in allergic asthma. Annals of Allergy & Asthma & Immunology. 112 (2), 108-115 (2014).
  9. Barnes, N., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of the CRTH2 antagonist OC000459 in moderate persistent asthma. Clinical & Experimental Allergy. 42 (1), 38-48 (2012).
  10. Medoff, B. D., et al. CD11b+ myeloid cells are the key mediators of Th2 cell homing into the airway in allergic inflammation. Journal of Immunology. 182 (1), 623-635 (2009).
  11. Oeser, K., Maxeiner, J., Symowski, C., Stassen, M., Voehringer, D. T. T cells are the critical source of IL-4/IL-13 in a mouse model of allergic asthma. Allergy. 70 (11), 1440-1449 (2015).
  12. Freeman, C. M., Curtis, J. L., Chensue, S. W. CC chemokine receptor 5 and CXC chemokine receptor 6 expression by lung CD8+ cells correlates with chronic obstructive pulmonary disease severity. The American Journal of Pathology. 171 (3), 767-776 (2007).
  13. Kallinich, T., et al. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of challenged asthmatic patients. Clinical & Experimental Allergy. 35 (1), 26-33 (2005).
  14. Vasakova, M., et al. Bronchoalveolar lavage fluid cellular characteristics, functional parameters and cytokine and chemokine levels in interstitial lung diseases. Scandinavian Journal of Immunology. 69 (3), 268-274 (2009).
  15. Campbell, J. J., et al. Expression of chemokine receptors by lung T cells from normal and asthmatic subjects. Journal of Immunology. 166 (4), 2842-2848 (2001).
  16. Halwani, R., et al. IL-17 Enhances Chemotaxis of Primary Human B Cells during Asthma. PLoS One. 9 (12), 114604 (2014).
  17. Agostini, C., et al. Cxcr3 and its ligand CXCL10 are expressed by inflammatory cells infiltrating lung allografts and mediate chemotaxis of T cells at sites of rejection. The American Journal of Pathology. 158 (5), 1703-1711 (2001).
  18. Ainslie, M. P., McNulty, C. A., Huynh, T., Symon, F. A., Wardlaw, A. J. Characterisation of adhesion receptors mediating lymphocyte adhesion to bronchial endothelium provides evidence for a distinct lung homing pathway. Thorax. 57 (12), 1054-1059 (2002).
  19. Radeke, H. H., Ludwig, R. J., Boehncke, W. H. Experimental approaches to lymphocyte migration in dermatology in vitro and in vivo. Experimental Dermatology. 14 (9), 641-666 (2005).
  20. Miles, A., Liaskou, E., Eksteen, B., Lalor, P. F., Adams, D. H. CCL25 and CCL28 promote alpha4 beta7-integrin-dependent adhesion of lymphocytes to MAdCAM-1 under shear flow. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 294 (5), 1257-1267 (2008).
  21. Zundler, S., et al. The alpha4beta1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn’s Disease Effector T Cells In vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  22. Verbist, K. C., Cole, C. J., Field, M. B., Klonowski, K. D. A role for IL-15 in the migration of effector CD8 T cells to the lung airways following influenza infection. Journal of Immunology. 186 (1), 174-182 (2011).
  23. Kopf, M., Abel, B., Gallimore, A., Carroll, M., Bachmann, M. F. Complement component C3 promotes T-cell priming and lung migration to control acute influenza virus infection. Nature Medicine. 8 (4), 373-378 (2002).
  24. Zundler, S., et al. Three-Dimensional Cross-Sectional Light-Sheet Microscopy Imaging of the Inflamed Mouse Gut. Gastroenterology. 153 (4), 898-900 (2017).
  25. Mzinza, D. T., et al. Application of light sheet microscopy for qualitative and quantitative analysis of bronchus-associated lymphoid tissue in mice. Cellular & Molecular Immunology. , (2018).
  26. Erturk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments. (89), 51382 (2014).
  27. Morita, H., et al. An Interleukin-33-Mast Cell-Interleukin-2 Axis Suppresses Papain-Induced Allergic Inflammation by Promoting Regulatory T Cell Numbers. Immunity. 43 (1), 175-186 (2015).
  28. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (123), 55450 (2017).
  29. Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Particle and Fibre Toxicology. 10, 38 (2013).
  30. Minton, C., et al. Demonstration of microvessel networks and endothelial cell phenotypes in the normal murine lung. Journal of Nippon Medical School. 72 (6), 314-315 (2005).
  31. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), 55398 (2017).
  32. Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  33. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  34. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  35. Wege, A. K. Humanized Mouse Models for the Preclinical Assessment of Cancer Immunotherapy. BioDrugs. , (2018).
  36. Jespersen, H., et al. Clinical responses to adoptive T-cell transfer can be modeled in an autologous immune-humanized mouse model. Nature Communications. 8 (1), 707 (2017).
  37. Schloder, J., Berges, C., Luessi, F., Jonuleit, H. Dimethyl Fumarate Therapy Significantly Improves the Responsiveness of T Cells in Multiple Sclerosis Patients for Immunoregulation by Regulatory T Cells. International Journal of Molecular Sciences. 18 (2), (2017).
  38. Murdoch, C., Finn, A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood. 95 (10), 3032-3043 (2000).
  39. Rivera-Nieves, J., Gorfu, G., Ley, K. Leukocyte adhesion molecules in animal models of inflammatory bowel disease. Inflammatory Bowel Diseases. 14 (12), 1715-1735 (2008).
  40. Zundler, S., Neurath, M. F. Novel Insights into the Mechanisms of Gut Homing and Antiadhesion Therapies in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (4), 617-627 (2017).
  41. Halim, T. Y., Krauss, R. H., Sun, A. C., Takei, F. Lung natural helper cells are a critical source of Th2 cell-type cytokines in protease allergen-induced airway inflammation. Immunity. 36 (3), 451-463 (2012).
  42. Kamijo, S., et al. IL-33-mediated innate response and adaptive immune cells contribute to maximum responses of protease allergen-induced allergic airway inflammation. Journal of Immunology. 190 (9), 4489-4499 (2013).
  43. Milne, J., Brand, S. Occupational asthma after inhalation of dust of the proteolytic enzyme, papain. British Journal of Industrial Medicine. 32 (4), 302-307 (1975).
  44. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  45. Ariel, P. A beginner’s guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  46. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  47. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  48. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2014).
  49. Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
  50. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  51. Hammad, H., et al. House dust mite allergen induces asthma via Toll-like receptor 4 triggering of airway structural cells. Nature Medicine. 15 (4), 410-416 (2009).
  52. Bose, O., et al. Mast cells present protrusions into blood vessels upon tracheal allergen challenge in mice. PLoS One. 10 (3), 0118513 (2015).
  53. Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).

Tags

Keywords: Lung HomingHuman LymphocytesAllergic InflammationLight-sheet MicroscopyT Cell Lung HomingInflammatory Lung DiseasesPapainFicollPBMCCD4+ T CellsCell Proliferation DyeAdoptive Transfer
check_url/fr/59043?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Schulz-Kuhnt, A., Zundler, S., Grüneboom, A., Neufert, C., Wirtz, S., Neurath, M. F., Atreya, I. Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59043, doi:10.3791/59043 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image