在这里, 我们提出了一个在体外培养结肠肠道微生物群的方案,使用一系列生物反应器, 模拟胃肠道的生理条件。
人体肠道微生物群在人类健康和疾病中都发挥着至关重要的作用。利用体内模型研究肠道微生物区系是困难的, 因为它的复杂性, 以及它与哺乳动物成分的不同联系。该协议的目的是在体外培养肠道微生物群, 从而能够研究肠道微生物群动态, 而不必考虑哺乳动物环境的贡献。利用体外培养技术, 模拟了胃肠道的生理条件, 包括 ph 值、温度、厌氧菌和转运时间等参数。通过添加黏液涂层载体, 创建黏膜相, 并添加进一步的维度, 模拟结肠的肠道表面。通过接种人体粪便材料, 引入肠道微生物群。在接种这种复杂的细菌混合物时, 特定的微生物在不同的纵向 (上升, 横向和下降冒号) 和横向 (腔和粘膜) 环境的体外模型中被丰富。至关重要的是, 要让系统达到稳定的状态, 在这种状态下, 社区和产生的代谢物保持稳定。本手稿的实验结果证明了接种肠道微生物群群落如何随着时间的推移发展成为一个稳定的群落。一旦达到稳定状态, 该系统可用于分析细菌相互作用和社区功能, 或测试任何添加剂对肠道微生物群的影响, 如食品、食品成分或药物。
肠道微生物群是一个微生物群落, 存在于人类胃肠道 (git) 中。 这个群落在结肠中达到最大浓度, 估计可容纳 10 13-1014 种细菌, 来自500-1000 种, 与结肠环境 1,2共生。肠道微生物群的组成和功能沿 git 发生了空间变化, 形成了区域特定的群落, 最多样化的是远端 2、3、4、5。对于每个解剖区域, 不同的微生物群落居住在腔内和粘膜衬里 6。当底物穿过腔室 7时 7时7时, 腔内社区可以更直接地获得营养物质。尽管如此, 一些细菌优先居住在粘液层, 利用结肠细胞产生的粘液作为能量来源1,5,8。腔内和黏膜相微环境的差异导致了分化和特定期群落的发育。这些群落共同提供代谢功能, 如营养代谢和维生素的产生, 以及免疫功能, 如防止人类病原体的殖民1,3,9. 肠道微生物区系在与人结肠细胞的共轭作用下也起作用3。
作为人类 git 的重要组成部分, 众所周知, 肠道微生物群对宿主健康和疾病状况的贡献3、9、10、11、12 也就不足为奇了。肠道微生物群的变化与多种人类疾病有关, 包括肠道疾病 (ibd) 和肠道综合征 (ibs) 等 git 疾病, 以及肥胖、循环系统疾病和自闭症等其他疾病3 个,9,10,11,12. 肠道微生物群产生的代谢物具有全球效应, 到达远离肠道的地方12、13.例如, 肠道-大脑轴与焦虑和抑郁等精神障碍有关.因此, 研究肠道微生物群对多个研究领域都很重要, 适用于许多疾病, 即使是那些与 git 并不经常相关的疾病。
虽然人们普遍承认, 研究肠道微生物群很重要, 但这是一项复杂的工作。有多种动物模型, 从斑马鱼、老鼠和老鼠等小动物, 到猴子和猪 15-19等较大的动物。然而, 这些动物在人体肠道微生物区系方面的应用并不简单, 因为这些动物有一个独特的细菌群落, 这种群落是在环境和饮食的基础上进化而来的, 它们在解剖上与人类不同,21. 使用人的主体消除了相关性问题, 但又带来了另一组挑战。人类研究是昂贵的, 耗时的, 并在道德上受到限制11。此外, 混淆因素影响肠道微生物群在人类研究中, 包括年龄或发育阶段, 环境, 饮食, 药物, 和遗传因素2,4, 22。 对可以在人类身上检测的东西, 以及可以在什么时候采集哪些类型的样本也有限制 4。
使用体内系统研究肠道微生物群的一个关键缺点是哺乳动物成分的存在。肠道微生物群和人体细胞相互作用, 在体内环境中, 不可能区分这两者。肠道微生物群产生的代谢物由结肠细胞吸收, 因此无法精确计算测量结果。因此, 任何机械研究都必须限于终点测量 11.体内研究的另一个主要缺点是无法纵向从 git 23 的不同区域采集样本.这不允许评估随着时间的推移结肠微环境中可能发生的变化 12. 包括人类研究在内的许多体内研究都依靠粪便样本分析来检测肠道微生物群的变化。虽然这是提供信息, 但它没有提供整个 git 肠道微生物群的数据, 也没有区分腔和黏膜群落 5、6、7、8。
对于肠道微生物群, 需要应用体外方法来研究细菌群落的动态, 而不受哺乳动物成分的干扰。使用体外方法可以严格控制环境条件 10, 同时测试多个参数, 并能够进行纵向采样, 并在大容量11。由于体外方法使用的是机械设备, 而不是主机, 因此不需要考虑年龄、环境、饮食或遗传背景。这些系统可以用来测试整个肠道微生物群群落, 只能测试选定的生物, 甚至是单一的菌株。重要的是, 体外结果是可重现的, 但仍保留了与体内研究11,22相当的多样性水平。
根据所涉及的假设和预期的结果, 可以通过多种方式进行体外研究。 它们可以利用单血管系统和简单的方法, 例如用粪便均质24小时孵化样品, 或在 24-48 25期间进行单批培养。它们还可以使用单血管系统和更复杂的方法来完成, 例如使用恒温器系统来产生稳定的肠道微生物群落11。然而, 使用单个反应器可以过度简化微生物群12,因为它只代表结肠的一个部分, 即使结肠是由上升、横向和下降区域组成的。
为了研究在结肠不同区域 (上升、横向和下降区域) 发育的肠道微生物群群落, 可以采用复杂的多阶段系统。在这些系统中, 建立了多个血管来模仿结肠的不同区域, 因此上升、横向和下降区域的肠道微生物群是独立培养的。这些容器是连接的, 使用泵按顺序移动基板, 从上升到横向到下降的结肠区域, 模仿营养物质通过 git 的流动。
本研究的目的是展示如何利用5个阶段的体外培养系统 (见材料表) 来培育肠道微生物群群落, 并展示稳定和组成方面的群落动态。在这个系统中, 一个血管代表胃, 一个代表小肠。冒号分为三个区域 (上升、横向、下降), 每个区域为26个区域.在这一实验设置中, 两个完整的系统并行运行, 第1单元包含粘液载体, 以表示黏膜表面, 第2单元不含粘液载体。利用 16s rrna 基因测序和 scfa 分析, 对每个区域在腔和黏膜阶段发育的群落进行了比较, 并对一段时间内的粪便接种进行了比较。所提供的结果证明了社区的类型, 无论是在组成和功能方面, 都可以从这种类型的体外系统中产生。
建立了体外培养系统, 研究大肠肠道微生物群。他们使用的设备设计, 以模拟胃肠道的生理条件, 促进一个成熟的肠道微生物群落的生长, 为结肠33的每个区域。虽然这个概念是合乎逻辑和可理解的, 但研究肠道微生物区系的体外培养系统的实际运行需要精确和了解所需的内容和预期产生可靠结果的情况。
体外肠道微生物区系实验所需的元素是, 群落在接种后必…
The authors have nothing to disclose.
奥黛丽·托马斯-加赫林女士因其 gcms 的工作而受到表彰。我们还要感谢马西莫·马尔佐拉蒂编辑的手稿。
TWINSHIME | Prodigest | NA | |
defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch) | Prodigest | NA | |
Masterflex tubing | cole Parmer | NA | |
Urine Drainage bag | Bard | NA | |
Labsorb | Sigma-Aldrich | NA | |
Fecal sample | Openbiome | NA | |
Syringes | Becton Dickson | NA | |
Defined medium | Prodigest | NA | |
Oxgall Bile | Becton Dickson | NA | |
Pancreatin | Sigma-Aldrich | NA | |
Glass ware | Ace Glass | NA | |
Porcine mucin | Sigma-Aldrich | NA | |
Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | NA | |
Sterilization pouches | VWR | NA | |
BeadBug | Benchmark Scientific | NA | |
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube | Benchmark Scientific | NA | |
RNAse free, DNAse free, sterile water | Roche | NA | |
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS | Shimadzu | NA | |
Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25µm | Restek | NA | |
plastic mucin carriers | Prodigest | NA |