X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선

Summary

시간이 해결 직렬 펨 결정학 실험의 성공 효율적인 샘플에 따라 달라 집니다. 여기, 우리는 프로토콜 최적화 높은 점도 마이크로 압출 인젝터에서 bacteriorhodopsin microcrystals의 입체 면을 설명 합니다. 방법론은 소설 3 방향 커플러와 샘플 균질 및 고속 카메라와 시각화에 의존합니다.

Abstract

높은 점도 마이크로 압출 인젝터는 극적으로 x 선 자유 전자 레이저 (XFELs)에서 직렬 펨 결정학 실험 (SFX)에서 샘플 소비를 감소 했습니다. 일련의 실험 빛 구동 양성자 펌프 bacteriorhodopsin를 사용 하 여 추가 설정한이 인젝터의 구조 변화를 해결 하려면 시간 해결 직렬 펨 결정학 (TR-SFX)에 대 한 결정을 제공 하는 기본 옵션으로 photoactivation 후 단백질입니다. 높은 품질의 여러 구조 스냅샷, 많은 양의 데이터를 수집 하 고 모든 펌프 레이저 펄스 사이의 결정의 보장에 필수적 이다. 여기, 우리가 어떻게 우리가 우리의 최근 TR SFX 실험 Linac 일관 된 빛 소스 (LCLS)에서 bacteriorhodopsin microcrystals의 입체 최적화 자세히 설명 합니다. 방법의 목표 속도 증가 하는 결정의 높은 밀도 유지 하면서 안정적이 고 지속적인 흐름에 대 한 압출을 최적화 하는 실험에서 TR SFX에 데이터를 수집할 수 있습니다. 우리 커플링 장치는 고속으로 찍은 압출 안정성의 측정에 따라 샘플 구성 조정 하 여 다음 소설 3-방법으로 주사기를 사용 하 여 결정의 균일 분포 lipidic 입방 단계를 준비 하 여이 목표를 달성 카메라 설정입니다. 방법론은 다른 microcrystals의 흐름을 최적화 하기 위해 적용할 수 있습니다. 설치는 새로운 스위스 자유 전자 레이저 시설 사용자가 가능할 것 이다.

Introduction

직렬 펨 결정학 (SFX)은 대부분의 잡기 동안 수천 마이크로미터 크기의 결정에서에서 x 선 자유 전자 레이저 (XFEL) 실 온 구조 결정의 독특한 속성을 이용 하는 구조 생물학 기술 “파괴 전에 회절” 원리^1,2,3방사선 손상.

시간 해결 SFX (TR-SFX) 확장,는 XFEL에서 펨 펄스는 단백질^4,5에 구조적인 변화를 공부 하는 데 사용 됩니다. 관심사의 단백질 XFEL 펌프-프로브 설치 프로그램에 의해 총 직전 광학 레이저 (또는 다른 활동 트리거) 활성화 됩니다. 정확 하 게 제어 함으로써 펌프와 프로브 펄스 사이의 지연, 다른 주에서 대상 단백질을 캡처할 수 있습니다. 시간 11 배나 통해 구조 변경의 분자 영화 보여 여러 단백질 목표^{6,7,,89의 역학을 공부 하는 새로운 XFEL 소스의 힘 10,11,,1213}. 주로, 메서드 원자 해상도 근처에서 단백질 역동성으로 엿볼 제공 동적 광 및 정적 구조 기술을 하나로, 조인.

TR-SFX에 대 한 간단한 시스템 bacteriorhodopsin (bR)^9,10에 망막, photosystem II^12,13, chromophores 같은 사진에 민감한 구성 요소 활성화의 내 생 트리거 포함 될 수 있습니다. 광 노란색 단백질 (PYP)^6,7 역 photoswitchable 형광 단백질¹¹또는 myoglobin⁸일산화 탄소 photolyzable. 기술 개발에 여전히의 흥미로운 변이 혼합에 의존 하 고 주사 제도^14,15 효소 반응 또는¹⁶구조적인 변화 유도 하는 데 사용 하는 전기 분야를 공부 하. XFEL 소스 겨우 사용할 수 있는 몇 년 동안 하 고 미래에 과거의 성공 바탕, 메서드를 보여 줍니다 방법에 대 한 우리의 이해에 관하여 진짜 게임 체인저로 잠재적인 단백질 기능.

생물 학적 샘플 단일 노출 고성능 XFEL 펄스에 의해 파괴 때문에 단백질 결정학에 새로운 접근 필요 했다. 이러한 절차 중 많은 양의 유니폼 microcrystals 성장 능력 개발된^17,,1819필요가 있었다. XFEL에 데이터 컬렉션을 사용 하려면 이러한 결정 전달, 삭제, 고 각 XFEL 펄스에 대 한 다음 갱신 있습니다. XFELs 10-120 Hz에서 사용 가능한 펄스 발생, 샘플 배달 해야 되지, 안정, 빠르고 안정적 또한 유지 결정 그대로 제한 소비 하면서. 가장 성공적인 솔루션 중 continiously 펄스 x-선 빔²⁰통해 실내 온도 크리스탈-라덴 lipidic 입방 단계 (LCP)의 열을 스트리밍을 제공 하는 높은 점성 마이크로 압출 인젝터가입니다. 무작위로 지향된 결정, XFEL 펄스 분산형 엑스레이 회절 패턴을 기록 하는 감지기에 의해 도청 하는 LCP 스트림에 포함. 그것은 자주 막 단백질 결정^17,21,,2223, 아직 다른 점도 캐리어 미디어 ^{성장 매체로 사용 LCP 샘플 전달 매체에 대 한 자연 선택은 24,25,26,,2728,29,30} 및 수용 성 단백질³¹ 또한 인젝터에 사용 되었습니다. 높은 점도 인젝터와 SFX 막 단백질^13,32 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)^{33,34, 등의 구조를 결정 하는 동안 성공 했습니다. 35,,3637}, 네이티브 위상^38,39 시간 및 효율적인 샘플 되는 동안에 대 한 충분 한 데이터 품질. 현재,이 인젝터는 사용 되 고 더 정기적으로 더 동안에 뿐만 아니라 싱크 로트 론 소스^28,30,,4041 에서 실내 온도 측정에 대 한 기술적으로 XFELs^9,10,,1342에서 TR SFX 실험을 요구.

그러나 유사한 TR SFX 실험 진행 되었습니다 밖으로 액체 단계 흐름에서 배달 집중 노즐^6,,712같은 다른 인젝터 종류를 사용 하 여,,이 방법은 많은 단백질 양을 사용할 수 없는 필요 합니다. 생물학적으로 목표를 재미 있는. 액체 제트에 대 한 10000 인덱싱된 회절 패턴 9.35 mg에 비해 당 단백질의 0.072 밀리 그램의 평균 소비 점성 돌출을 사용 하 여 정적 구조체의 결정에 대 한 노즐 (즉, 130 배 더 많은 샘플에 대해 보고 되었습니다. 효율적인)²⁰. 고 점도 인젝터만이 샘플 효율⁴³의 일부 희생 하면서 TR SFX를 위한 실행 가능한 샘플 배달 장치를 보였다. Nogly 외. (2018)에¹⁰, 예를 들어 샘플 소비는 약 1.5 m g 10000 인덱싱된 패턴 당 평균 샘플 소비는 74 밀리 그램의 10000 당 단백질의 훨씬 더 높은 PYP를 사용 하 여 비슷한 TR SFX 실험을 호의적으로 비교 하는 인덱싱된 패턴⁶. 고 점도 인젝터는 따라서 사용 가능한 단백질의 양을 제한 하거나 결정 LCP 직접 재배 명확한 장점이 있다.

TR-SFX 높은 점도 사용 하 여에 대 한 몇 가지 기술적인 문제가 가장 신뢰할 수 있는 데이터를 인젝터 해결 해야: 흐름 속도 최소 임계값; 위에 남아 있어야 히트-속도 느린 데이터 컬렉션을 렌더링 하지 않는 수준에서 유지 되어야 한다 (예를 들어, 보다 큰 5%); 샘플 과도 한 중단 없이 전달 했다. 이상적으로, 이러한 조건을 이미 충족 하는 사용 가능한 XFEL 시간을 가능한 한 효율적으로 사용 하는 예약 된 TR SFX 실험 하기. Pricipally, LCP 스트림의 둔화 이상의 광학 레이저 펄스와 혼합된 활성 상태에 결과 활성화 된 결정 프로 빙 또는 umpumped 물자는 빔에 예상 되는 경우 펌핑된 소재를 프로 빙 수. 있습니다 사출 사전 테스트의 추가 혜택은 강등 압출 비 샘플 변경 막힌된 노즐을 교체 하는 시간으로는 XFEL에서 데이터 수집 하는 동안 가동 중지 시간 최소화 및 기타 유지 관리 작업 감소.

여기, 우리는 높은 점도 마이크로 압출 인젝터와 TR SFX 데이터 컬렉션에 대 한 샘플 배달을 최적화 하는 방법을 제시. 편의상, 설명된 방법 의존 하지 마십시오 X-ray 소스에 액세스할 수 있지만 싱크 로트 론 beamline²⁹ 일 것 이다 추가 제공 정보 예상된 적중된 속도 크리스탈 회절에. 우리의 프로토콜 양성자 펌프 bacteriorhodopsin¹⁰ 에 망막 isomerization 캡처 실험을 최적화 하기 위해 개발 되었다 고 돌출을 모니터링 하 여 다음 돌출 크리스탈 샘플을 준비와 함께 시작 하는 두 단계에서 수행 됩니다. 고속 카메라 설치를 사용 하 여. 1 단계에서 결정-라덴 LCP 최종 혼합물은 막힘 또는 감속 없이 배달 샘플 환경에 적합 하도록 추가 LCP, 낮은 전환 온도 지질 또는 다른 첨가제 혼합입니다. 새로운 3 방향 주사 통 커플러는 혼합 성능 및 샘플 동질성을 개선 하기 위해 개발 되었다. 직접 압출 속도 안정성을 측정 하는 고속 카메라에 의해 기록 된 압출 테스트 두 번째 단계에 의하여 이루어져 있다. 비디오 데이터의 분석에 따라 조정 할 수 있다 샘플 준비 프로토콜에 실험 결과 개선 하기 위해. 이 절차는 최소한의 수정, TR-SFX 데이터 수집을 위해 준비 하는 다른 단백질을 적응 시킬 수 있다 및 제한 XFEL beamtime의 효율적인 사용에 기여할 것입니다. 그냥 그들의 작업^44,45 synchrotrons^{28,30,40,41 인젝터 기반 직렬 데이터 수집 방법의 전송 시작 하는 새로운 XFEL 시설} , 다음 몇 년 동안 확실 하 게 계속 제공할 것 이다 단백질 목표의 적 넓은 범위의 구조 역학에 대 한 흥미로운 새로운 통찰력.

Protocol

1. 단백질 크리스탈 샘플 준비 약 30 분 전에 샘플, 주입 하는 것입니다 monoolein 크리스탈-라덴의 부하 50 µ L 100 µ L 주사기에 LCP을 기반으로. 대기압에서 주입에 대 한: 부하 10 µ L 주사기를 두 번째의 뒤쪽으로 액체 파라핀의. 수직으로 주사기를 들고, 주사기에서 공기 방울을 추방. 진공 환경으로 주입에 대 한: 매기 7.9와 두 번째 주사기의 뒤쪽으로 액체 파라핀의 5 µ L의 부하 5…

Representative Results

여기에 설명 된 절차 (그림 3)에 대 한 이상적인 시작 물자는 인젝터를 위한 점성 운반대 매체에 통합 하는 microcrystals의 높은 밀도 이다. 절차의 크리스탈 라덴 각 준비를 위해 약 50 µ L에 대 한 호출합니다. 이러한 bR9,10 여기, 예를 들어 (그림 4), 사용 또는 기존의 증기 확산 설정에서 ?…

Discussion

점성 돌출 인젝터와 TR SFX 메서드 bacteriorhodopsin^9,10 , photosystem II¹³ 의 구조 역학 연구에 대 한 가능한 기술을 입증 하 고 지금 공부 단백질 다른 운전 준비가 보인다 사진 빛 구동 이온 전송 등 감각 지 각^5,50생물 학적 프로세스. 위에서 설명한 프로토콜 bacteriorhodopsin, TR-SFX 데이터 컬렉션의 성공…

Materials

Mosquito LCP Syringe Coupling	TTP labtech store	3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl	Hamilton	HA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl	Hamilton	HA-81265
Monoolein	Nu-Chek Prep, Inc.	M-239
7.9 MAG	Avanti Polar Lipids Inc.	850534O
50% w/v PEG 2000	Molecular Dimensions	MD2-250-7
Paraffin (liquid)	Sigma-Aldrich	1.07162
High speed camera	Photron		Photron Mini AX
High magnification lens	Navitar		12X Zoom Lens System
Three axis stage	ThorLabs	PT3/M
Fiber light	Thorlabs	OSL2
Fused silica fiber	Molex/Polymicro	TSP-505375
Lite touch ferrule	IDEX	LT-100
ASU high viscosity injector	Arizona State University		Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pump	Shimadzu	LC-20AD
Electronic gas regulator	Proportion Air	GP1