微結晶の時間分解フェムト秒シリアル結晶学 x 線レーザーのための高粘度押出を改善
Summary
シリアル フェムト秒の時間分解構造解析実験の成功は、効率的なサンプル配信に依存します。ここでは、我々 は高粘度 404 マイクロ押出しインジェクターからバクテリオロドプシン微結晶の押し出しを最適化するためにプロトコルを説明します。方法論は小説 3 ウェイ カプラー サンプルの均質化と高速度カメラによる可視化に依存しています。
Abstract
高粘度 404 マイクロ押出しインジェクターは、x 線自由電子レーザー (Xfel) でシリアル フェムト秒結晶構造実験 (特撮) のサンプル消費を飛躍的に短縮しています。一連の光駆動プロトン ポンプ バクテリオロドプシンを使用して実験がシリアル フェムト秒の時間分解結晶構造解析 (TR 特撮) の構造の変更を解決するための結晶を提供する希望のオプションとしてこれらのインジェクターを設立してさらにphotoactivation 後蛋白質。高品質の複数の構造スナップショットを得るためには、大量のデータを収集し、すべてのポンプ レーザー パルス間結晶のクリアランスを確認することが不可欠です。ここでは、我々 は我々 は最近 TR SFX 実験リニアック コヒーレント光ソース (ローレンスリバモア) でのバクテリオロドプシンの微結晶の押し出しを最適化する方法の詳細について説明します。メソッドの目的は安定的かつ継続的な流れの率を高めるため結晶の高密度を維持しながら押出を最適化、TR SFX で収集できるデータで実験します。我々 は高速で撮影した押出成形安定性の測定に基づくサンプル組成を調整することによって続いてデバイスのカップリング小説 3 ウェイ シリンジを用いた結晶の均一な分布を持つ脂質キュービック相を準備することによってこの目標を達成します。カメラのセットアップ。方法論は、他の微結晶の流れを最適化するために合わせることができます。セットアップは新しいスイスの自由電子レーザー施設のユーザーに対して利用可能になります。
Introduction
シリアル フェムト秒結晶 (特撮) のほとんどを追い越すときのミクロン サイズの結晶の数千から x 線自由電子レーザー (XFEL) 部屋の温度構造を決定するためのユニークな特性を悪用する構造生物学手法です。「破壊の前に、回折」原則1,2,3による放射線被害。
特撮 (TR 特撮) の時間分解拡張機能、XFEL からフェムト秒パルスは蛋白質4、5の構造変化を研究に使用されます。興味の蛋白質は、ポンプ ・ プローブのセットアップで XFEL に撃たれる直前に光レーザー (または別のアクティビティのトリガー) でアクティブ化されます。ポンプ ・ プローブのパルス間の遅延を正確に制御するには、によって異なる状態で標的タンパク質をキャプチャできます。一時間で 11 桁構造変化の分子の映画はいくつか蛋白質ターゲット6,7,8,9、ダイナミクスを研究する新たな XFEL 源のパワーを発揮します。 10、11,12,13。主に、メソッドは、近くの原子分解能でのタンパク質ダイナミクスに垣間見ることを提供する 1 つに、動的な分光学的および静的構造技術を結合します。
TR SFX のシンプルなシステムが活性化バクテリオロドプシン (bR)9,10で網膜、光化学系 II12,13、発色団のような写真に敏感な部品の内因性のトリガーを含めることができます。イエロープロテイン (PYP)6,7可逆的スイッチング蛍光タンパク質の11、または photolyzable 一酸化炭素ミオグロビン8。まだ開発中の技術のエキサイティングなバリエーションはミックスに依存しており、注入方式14,15酵素反応や構造変化16を誘導するために使用される電界を研究します。XFEL 源のみ利用されている数年間、過去の成功を将来的に外挿する、表示方法の理解に関して実際のゲームチェンとして潜在的なタンパク質機能。
生物試料は、ハイパワー XFEL パルスに単一の露出によって破壊されて、ためタンパク質結晶構造解析への新しいアプローチが必要でした。これらの手順の中で大量の制服微結晶を成長する能力開発17,18,19をする必要があります。XFEL でデータの収集を有効にするには、これらの結晶は、配信される必要があります破棄され XFEL パルスごとに更新し。Xfel 火 10 120 Hz でパルスを使用可能なことを考える、サンプル出荷はまた結晶そのままと制限消費量を維持しながら高速、安定した、信頼性の高いをある必要があります。最も成功したソリューションの中ではパルス x 線ビーム20室温結晶を含んだ脂質キュービック相 (LCP) の列をストリーミング連続を提供する高粘度 404 マイクロ押出しインジェクターです。ランダム配向結晶は、XFEL パルス散乱 x 線回折パターンが記録されている検出器の上に、受け取る LCP ストリームに埋め込まれます。膜タンパク質の結晶17,21,22,23、まだ他の高粘度キャリア メディアの成長媒体として多用される LCP サンプル配信媒体のための自然な選択だった24,25,26,27,28,29,30と可溶性タンパク質31もインジェクターの中に使用されています。高粘度インジェクター付き SFX は膜蛋白質13,32 G タンパク質共役受容体 (Gpcr)33,34,などの構造決定に成功しています。 35,36,37, ネイティブ位相38,39時間と効率的なサンプルでありながら十分なデータ品質。室温測定放射ソース28,30,40,41でだけでなくより多くのこれらの噴射装置がより日常的に使用されている現在、技術的にXfel9,10,13,42TR SFX 実験を要求しています。
匹敵する TR SFX 実験を行った流れで配信集中ノズル6,7,12液相のような他のインジェクターの種類を使用して、ただし、このメソッドは、多くの蛋白質量は使用できませんを必要とターゲットは生物学的に興味深い。液体ジェットの粘性押し出し 9.35 mg と比較して 10,000 インデックス付き回折パターンあたり蛋白質の 0.072 mg の平均消費量を使用して静的な構造の決定のためノズルは、(すなわち、約 130 倍以上サンプル報告されています。効率的な)20。高粘度インジェクターは、のみこのサンプル効率43のいくつかを犠牲にして TR SFX のための実行可能なサンプル配信デバイスに示されています。Nogly et al. (2018)10、たとえば、サンプル消費が平均サンプル消費された 10,000 人当たりのタンパク質の 74 mg と高く PYP を使用して同様の TR SFX 実験に遜色を 10,000 のインデックス付きパターンあたり約 1.5 mgインデックス付きパターン6。高粘度インジェクターは、利用できる蛋白質の量を制限する場合、または直接 LCP で結晶が成長したがって明確な利点を持っています。
対処する必要があります TR SFX 高粘度を使用して最も信頼性の高いデータをいくつかの技術的な問題に屈するインジェクター: 流れの速度が最小しきい値; 上記おく必要があります。ヒット率は、データ コレクションが遅いが表示されないレベルで維持されるべき (例えば、5% より大きい); サンプルで、過度の中断することがなく配信されます。理想的には、これらの条件が既に満たされて使用可能な XFEL 時間をできるだけ効率的に使用するスケジュールされた TR SFX 実験の前に長い。Pricipally、LCP ストリームの減速は、混合のアクティブな状態になり、1 つ以上の光レーザー パルスで活性化した結晶をプロービングまたはビームの umpumped 素材が予想される場合、励起物質をプロービングすることは可能です。インジェクションの事前テストの追加の利点は非押し出しのサンプルを変更する、詰まったノズルの取り付けに追いやられて時間として、XFEL でデータ収集時のダウンタイムを最小化し、他の保守タスクが減少します。
高粘度 404 マイクロ押出しインジェクター付き TR 特撮データ コレクションのサンプル配信を最適化する方法を紹介します。便宜上、説明方法に頼らない、x 線源へのアクセス29放射光ビームラインでの仕事とは、さらに情報予想的中率と結晶回折の。私達のプロトコル プロトン ポンプ バクテリオロドプシン10レチナールの異性化をキャプチャする実験を最適化するために開発された、押出、押出の監視が続く結晶試料の準備から始まる 2 つのフェーズで実施されます。高速カメラのセットアップを使用します。1 つの段階で結晶を含んだ LCP は最終的な混合物が目詰まりまたは減速せずサンプル環境に配信に適したことを確認する追加 LCP、低い転移温度脂質または他の添加剤を混ぜています。新しいスリーウェイシリンジ カプラーは、混合性能、サンプルの均質性を改善するために開発されました。2 番目のフェーズは、直接押出速度の安定性を測定するための高速カメラによって記録された押出試験で構成されます。ビデオのデータの分析の結果、調整させることができますサンプル準備のプロトコル実験的転帰を改善します。これらの手順は、TR SFX のデータ収集、最小限の変更で他の蛋白質を準備に適応することができ、限られた XFEL ビームタイムの効率的な使用に資する。その操作44,45とシンクロトロン28,30,40,41 にインジェクター ベースのシリアル データ収集方法の転送を始めて新しい XFEL 施設、今後数年間は確かに標的蛋白質のこれまでより広い範囲の構造ダイナミクスのエキサイティングな新しい洞察を提供していきます。
Protocol
Representative Results
Discussion
TR SFX 粘性押し出しインジェクターによるバクテリオロドプシン9,10と光化学系 II13の構造ダイナミクス研究の現実的な手法であると証明したし、今他を運転する蛋白質を研究する準備ができています。写真光駆動イオン輸送や知覚5,50などの生物学的プロセス。上記プロトコルがバクテリ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は、PSI の高粘度注入器の使用をサポートするためゲプハルト Schertler、ラファエル Abela、クリス ・ ミルンを認めます。リチャード Neutze と彼のチームを時間分解構造解析と高粘度のインジェクターを使用してサンプル配信に関する議論を認めています。金融サポート、我々 を認める 31003A_159558 (バッハ) に助成金 31003A_141235 のスイスの全米科学財団と (P.N.) に PZ00P3_174169。このプロジェクトは、欧州連合のホライゾン 2020年研究とキュリー マリアスクウォドフスカ助成契約なし 701646 の下で革新プログラムからの資金を受けています。
Materials
| Mosquito LCP Syringe Coupling | TTP labtech store | 3072-01050 | |
| Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl | Hamilton | HA-81065 | |
| Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl | Hamilton | HA-81265 | |
| Monoolein | Nu-Chek Prep, Inc. | M-239 | |
| 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids Inc. | 850534O | |
| 50% w/v PEG 2000 | Molecular Dimensions | MD2-250-7 | |
| Paraffin (liquid) | Sigma-Aldrich | 1.07162 | |
| High speed camera | Photron | Photron Mini AX | |
| High magnification lens | Navitar | 12X Zoom Lens System | |
| Three axis stage | ThorLabs | PT3/M | |
| Fiber light | Thorlabs | OSL2 | |
| Fused silica fiber | Molex/Polymicro | TSP-505375 | |
| Lite touch ferrule | IDEX | LT-100 | |
| ASU high viscosity injector | Arizona State University | Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu) | |
| HPLC pump | Shimadzu | LC-20AD | |
| Electronic gas regulator | Proportion Air | GP1 |
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