JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chimie

Microcrystals yüksek viskozite ekstrüzyon için zaman karar vermek seri halinde Femtosecond kristalografisi x-ışını lazerleri iyileştirilmesi

Published: February 28, 2019
doi:
10.3791/59087
, , , , , , , ,
1Division of Biology and Chemistry – Laboratory for Biomolecular Research,Paul Scherrer Institut, 2Photon Science Division – SwissFEL,Paul Scherrer Institut, 3RIKEN SPring-8 Center, 4Department of Cell Biology, Graduate School of Medicine,Kyoto University, 5Department of Biology,ETH Zürich

Summary

Bir seri femtosecond zaman çözüldü kristalografisi deney başarısı verimli örnek Teslimde bağlıdır. Burada, bacteriorhodopsin microcrystals bir yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör üzerinden ekstrüzyon optimize etmek için iletişim kuralları açıklar. Metodoloji bir roman üç yönlü bağlaştırıcı ile örnek homojenizasyon ve görselleştirme ile yüksek hızlı bir fotoğraf makinesi yararlanır.

Abstract

Yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektörleri büyük ölçüde X-ray serbest elektron lazerler (XFELs) seri femtosecond crystallographic deneyler (SFX) örnek tüketimi azaltılmıştır. Işık tahrik proton pompa bacteriorhodopsin kullanarak deneyler bir dizi daha fazla kurduk bu enjektörler kristalleri yapısal değişiklikleri gidermek zaman karar vermek seri halinde femtosecond kristalografisi (TR-SFX) için teslim etmek için tercih edilen bir seçenek olarak proteinler photoactivation sonra. Birden çok yapısal anlık görüntülerini yüksek kalite elde etmek için büyük miktarda veri toplamak ve kristalleri her pompa lazer nabız arasında boşluk sağlamak için önemlidir. Burada, biz nasıl biz bacteriorhodopsin microcrystals ekstrüzyon son TR SFX deneylerimiz Linac tutarlı ışık kaynağı (LCLS), en iyi şekilde ayrıntılı olarak tarif. Yönteminin amacı artış oranı kristallerinin yüksek yoğunluklu koruyarak ekstrüzyon istikrarlı ve sürekli bir akış için en iyi duruma getirmektir deneme veri TR SFX içinde de toplanabilir. Biz lipidik küp aşama kristalleri ile yüksek hızlı alınan ekstrüzyon istikrar tedavinin temel örnek kompozisyon ayarlayarak takip cihazı kaplin roman üç yollu kullanarak homojen dağılımı ile hazırlayarak bu hedefe ulaşmak kamera ayarları. Metodoloji diğer microcrystals akışını optimize etmek için adapte edilebilir. Belgili tanımlık tertibat yeni İsviçre ücretsiz elektron lazer tesis kullanıcıları için kullanılabilir hale gelir.

Introduction

Seri femtosecond kristalografisi (SFX) x-ışını serbest elektron lazerler (XFEL) oda sıcaklığında yapıları belirlemek için benzersiz özellikler yararlanan bir Yapısal Biyoloji mikrometre ölçekli kristalleri binlerce çoğu ekme tekniktir radyasyon hasarı “kırınım imha önce” ilke1,2,3.

Bir zaman çözüldü uzantısı SFX (TR-SFX) içinde XFEL üzerinden femtosecond bakliyat proteinler4,5yapısal değişiklikleri incelemek için kullanılır. Protein ilgi bir optik lazer (ya da başka bir etkinlik tetikleyici) ile sadece bir pompa-sonda kurulumunda XFEL tarafından önce vurulduğunu etkinleştirilir. Tam olarak pompa ve sonda nabız arasında gecikme kontrol ederek, hedef protein farklı eyaletlerde geçirilerek. Onbir büyüklük zamanında üzerinde yapısal değişikliklerin moleküler Filmler çeşitli protein hedefleri6,7,8,9dynamics çalışmaya yeni XFEL kaynakları güç göstermek, 10,11,12,13. Prensip olarak, yöntem dinamik spektroskopik ve statik yapı teknikleri bir, atomik çözünürlük yakınındaki protein dynamics içine bir bakış sağlayan katılır.

TR-SFX için basit sistemleri harekete geçirmek ile bir fotoğraf duyarlı bileşeni retina bacteriorhodopsin (bR)9,10, photosystem II12,13‘ te kromofor gibi endojen bir tetikleyici içerebilir, fotoaktif sarı protein (PYP)6,7 ters photoswitchable floresan protein11veya photolyzable karbon monoksit miyoglobin8. Hala geliştirme tekniği heyecan verici varyasyonları mix itimat ve enzimatik reaksiyonlar ya da yapısal değişiklikler16ikna etmek için kullanılan elektrik alan eğitim programları14,–15 enjekte. XFEL kaynakları sadece be elde edilebilir için birkaç yıl ve başarıları geleceğe extrapolating, yöntemi nasıl bizim anlayış açısından gerçek bir oyun değiştirici olarak potansiyel gösterir verilen bu proteinlerin işlevi.

Biyolojik örnekleri tek bir yüksek güç XFEL darbe maruz tarafından yok edilir çünkü protein kristalografisi yeni yaklaşımlar gerekliydi. Bu yordamları arasında Tekdüzen microcrystals büyük miktarda büyümeye yeteneği gelişmiş17,18,19olması gerekiyordu. Bir XFEL, veri toplamayı etkinleştirmek için bu kristaller gerekir teslim, atılan olup her XFEL darbe için yenilendi. XFELs 10-120 Hz’de kullanışlı bakliyat ateş göz önüne alındığında, örnek teslimat da sağlam ve sınırlayıcı tüketimi kristalleri tutarken hızlı, istikrarlı ve güvenilir, olmalıdır. Arasında en başarılı çözümler oda sıcaklığında kristal yüklü lipidik üçüncü aşama (LCP) sütunun pulsed röntgen ışını20akarsu bir işletmesi teslim etmek yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör var. Rastgele odaklı kristalleri, gömülü nerede bir kırınım deseni kaydedilir bir Dedektör üzerine XFEL bakliyat dağılım x-ışınları tarafından yakalanan LCP akışında. Sık sık membran protein kristalleri17,21,22,23için henüz diğer yüksek viskozite taşıyıcı medya bir büyüme aracı olarak kullanıldığı gibi LCP bir örnek teslim orta için doğal bir seçim yapıldı. 24,25,26,27,28,29,30 ve çözünür proteinler31 de kullanıldığını enjektör içinde. SFX yüksek viskozite enjektör ile membran proteinleri13,32 G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs)33,34dahil yapısı belirlenmesi sırasında başarılı olmuştur, 35,36,37, hem zaman hem de örnek etkili olurken yerli aşamalı38,39 için yeterli veri kalitesiyle. Şu anda, bu enjektörler daha düzenli olarak Oda sıcaklık ölçümleri sinkrotron kaynakları28,30,40,41 yanı sıra daha fazla sırasında için kullanılmakta olan teknik olarak TR-SFX deneyler XFELs9,10,13,42talep.

Karşılaştırılabilir TR SFX deneyler sıvı faz teslim akışı başlığı6,7,12odaklanmış gibi diğer enjektör türleri kullanılarak gerçekleştirilen, ancak, bu yöntem için pek çok protein miktarları mevcut değil gerektirir biyolojik olarak ilginç hedefleri. Viskoz ekstrüzyon bir ortalama tüketimi başına 10.000 dizin oluşturulmuş kırınım desenleri ile karşılaştırıldığında 9,35 mg protein 0,072 mg için sıvı jet kullanarak statik yapılar belirlenmesi için püskürtme (yani, 130 kat daha fazla örnek hakkında bildirilmiştir verimli)20. Yüksek viskozite enjektör sadece bu örnek verim43bazıları feda ederken uygun örnek teslimatı için TR SFX olmak gösterilmiştir. İçinde Nogly ve ark. (2018)10, örneğin, örnek tüketimi yaklaşık 1,5 olumlu nerede ortalama örnek tüketimi çok daha yüksek protein başına 10.000 74 mg ile PYP kullanarak benzer TR SFX deneyleri için karşılaştıran mg başına 10.000 dizin oluşturulmuş desen, yapıldı. Dizin oluşturulmuş desen6. Yüksek viskozite enjektörleri böylece protein mevcut miktarını sınırlayarak veya kristaller doğrudan LCP yetiştirilmektedir açık avantajları vardır.

TR-SFX için yüksek viskozite kullanarak birkaç teknik sorunları en güvenilir veri vermeye enjektörleri ele alınması gerekmektedir: akış hızı en az kritik değeri; kalmaya ihtiyacı isabet oranı veri toplama yavaş işlemez bir düzeyde muhafaza edilmelidir (örneğin, % 5’den büyük); ve örnek aşırı aksamalar teslim edilecek. İdeal olarak, bu koşullar zaten yerine kullanılabilir XFEL zamanı olabildiğince verimli bir şekilde kullanmak için uzun bir zamanlanmış TR SFX deneyin önce. Pricipally, bir yavaşlama LCP akışındaki birden fazla optik lazer nabız ve sonuç karışık etkin Birleşik Devletleri ile etkinleştirildi kristalleri problama veya umpumped malzeme ışının içinde beklenen pompalanan malzeme sondalama izin verebilir. Enjeksiyon öncesi test ek bir yararı, bir XFEL, veri toplama sırasında kapalı kalma saat başlıklarının tıkalı olmayan ekstrüzyon örnekleri, değiştirme, değiştirme için küme olarak küçültülür ve diğer bakım görevleri azaltılır olmasıdır.

Burada, örnek teslim yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör ile TR SFX veri toplama için en iyi duruma getirmek için bir yöntem mevcut. İş yerinde bir sinkrotron beamline29 daha fazla bilgi beklenen isabet oranları ve kristal kırınım sağlamak, ancak kolaylık olması için açıklanan yöntemleri bir x-ışını kaynağına erişim güvenmeyin. Protokolümüze deneyler proton pompa bacteriorhodopsin10 retina isomerization yakalamak için en iyi duruma getirmek için geliştirilmiştir ve Ekstrüzyon ekstrüzyon izleyerek takip için kristal örnekleri hazırlama ile başlayan iki aşamada yapılmaktadır bir yüksek hızlı kamera Kurulumu kullanarak. Bir aşamasında, kristal yüklü LCP ek LCP, düşük geçiş sıcaklığı lipidler veya diğer katkı maddeleri son karışımı tıkanma veya yavaşlama’dır örnek ortamına uygun olduğundan emin olmak için ile karıştırılır. Yeni bir üç yönlü şırınga coupler karıştırma performans ve örnek homojenliği geliştirmek için geliştirilmiştir. İkinci aşama doğrudan ekstrüzyon hızı istikrar ölçmek için yüksek hızlı bir kamera tarafından kaydedilen bir ekstrüzyon testi oluşur. Video veri analizi, deneysel sonuçlar geliştirmek için örnek hazırlama protokolü için ayarlamalar yapılabilir. Bu yordamları en az değişikliklerle TR SFX veri toplama için diğer proteinler hazırlamak için uyarlanmış ve sınırlı XFEL beamtime verimli kullanmak için katkıda bulunacaktır. Sadece onların işlemi44,45 ve enjektör tabanlı seri veri toplama yöntemleri transfer synchrotrons28,30,40,41 başlayan yeni XFEL imkanları ile , önümüzdeki birkaç yıl mutlaka protein hedefleri hiç daha geniş bir yelpazesi yapısal dinamikleri heyecan verici yeni görüşler sağlamaya devam edecektir.

Protocol

1. protein Crystal numune hazırlama Örnek enjekte edilebilir için önce yaklaşık 30 dk monoolein kristal yüklü yük 50 µL 100 µL şırıngada LCP dayalı. Atmosfer basıncında enjeksiyon için: ikinci bir şırınga arkası içine Sıvı parafin, yük 10 µL. Şırınga dikey tutarak, şırıngadan hava kabarcıkları sınırdışı. Vakum ortamı içine enjeksiyon için: yük 5 µL MAG 7,9 ve ikinci bir şırınga arkası içine Sıvı parafin 5 µL. Şırınga dikey tutarak, şır?…

Representative Results

Burada açıklanan yordamları (şekil 3) için ideal başlangıç malzeme için enjektör viskoz taşıyıcı orta dahil microcrystals yüksek yoğunlukları vardır. Kristal bin Ladin’in taşıyıcı her hazırlık için yaklaşık 50 µL için yordamı çağırır. Bunlar doğrudan içinde LCP burada, örneğin (şekil 4), kullanılan veya geleneksel buharı difüzyon kurulumları içinde yetiştirilen kristalleri kullanılara…

Discussion

TR-SFX yöntemi ile viskoz ekstrüzyon enjektör bacteriorhodopsin9,10 photosystem II ve13 yapısal dynamics çalışmaları için uygun bir teknik olduğu kanıtlanmıştır ve şimdi diğer sürüş proteinler çalışmaya hazır görünüyor İyon ışık temelli taşıma veya duyusal algı5,50fotoğraf biyolojik işlemler. Yukarıda açıklanan protokoller bacteriorhodopsin TR-…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gebhard Schertler, Rafael Abela ve Chris Milne yüksek viskozite enjektörleri PSI adlı kullanımını desteklemek için anıyoruz. Richard Neutze ve ekibi tartışmalar zaman çözüldü kristalografisi ve yüksek viskozite enjektörleri kullanarak örnek teslimat için kabul vardır. Mali destek için hibe 31003A_141235, 31003A_159558 (js için) İsviçre Ulusal Bilim Vakfı anıyoruz ve PZ00P3_174169 (için P.N.). Bu proje Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı kapsamında Marie-Sklodowska-Curie hibe sözleşmesi No 701646 fon aldı.

Materials

Mosquito LCP Syringe Coupling TTP labtech store 3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µl Hamilton HA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µl Hamilton HA-81265
Monoolein Nu-Chek Prep, Inc. M-239
7.9 MAG Avanti Polar Lipids Inc. 850534O
50% w/v PEG 2000 Molecular Dimensions MD2-250-7
Paraffin (liquid) Sigma-Aldrich 1.07162
High speed camera Photron Photron Mini AX
High magnification lens Navitar 12X Zoom Lens System
Three axis stage ThorLabs PT3/M
Fiber light Thorlabs OSL2
Fused silica fiber Molex/Polymicro TSP-505375
Lite touch ferrule IDEX LT-100
ASU high viscosity injector Arizona State University Purchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pump Shimadzu LC-20AD
Electronic gas regulator Proportion Air GP1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  5. Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
  6. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  7. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
  8. Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
  9. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  10. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), (2018).
  11. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
  12. Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
  13. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  14. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  15. Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , 1364-1366 (2014).
  16. Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
  17. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  18. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
  19. Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
  20. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
  21. Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
  22. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  23. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
  24. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
  25. Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
  26. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
  27. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
  28. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  29. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
  30. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
  31. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
  32. Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. “Hit and run” serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
  33. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  34. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  35. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
  36. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  37. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
  38. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
  39. Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
  40. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  41. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
  42. Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
  43. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  44. Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
  45. Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
  46. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
  47. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
  48. James, D. . Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
  49. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  50. Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).

Tags

High Viscosity ExtrusionMicrocrystalsTime-resolved Serial Femtosecond CrystallographyX-ray LasersLCPMonooleinMAG 7.9Liquid ParaffinSyringeCubic PhaseExtrusion TestingHPLC Pump

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
James, D., Weinert, T., Skopintsev, P., Furrer, A., Gashi, D., Tanaka, T., Nango, E., Nogly, P., Standfuss, J. Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers. J. Vis. Exp. (144), e59087, doi:10.3791/59087 (2019).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image