Assorbimento di nuove nanoparticelle rivestite con lipidi contenenti Falcarindiol di cellule staminali mesenchimali umane
Summary
Questo articolo viene descritto l’incapsulamento di falcarindiol in nanoparticelle di nm 74 del lipido-rivestite. L’assorbimento cellulare delle nanoparticelle di cellule staminali umane in goccioline del lipido è monitorato da formazione immagine di fluorescenza e confocale. Le nanoparticelle sono fabbricate con il metodo di iniezione rapida di solvente spostando e loro dimensione viene misurata con la tecnica di dispersione della luce dinamica.
Abstract
Le nanoparticelle sono al centro di un crescente interesse in sistemi di drug delivery per la terapia del cancro. Nanoparticelle lipidiche rivestite sono ispirate nella struttura e dimensione lipoproteine a bassa densità (LDL) perché le cellule tumorali hanno una maggiore necessità di colesterolo a proliferare, e ciò è stata sfruttata come un meccanismo per la consegna di farmaci anticancro per cancro cellule. Inoltre, a seconda di chimica di droga, che incapsula il farmaco può essere vantaggioso per evitare il degrado della droga durante la circolazione in vivo. Pertanto, in questo studio, questo disegno è usato per fabbricare nanoparticelle rivestite con del lipido della falcarindiol farmaco anticancro, fornendo un potenziale nuovo delivery system di falcarindiol al fine di stabilizzare la sua struttura chimica contro il degrado e migliorare la assorbimento dai tumori. Nanoparticelle di Falcarindiol, con un monostrato di fosfolipidi e colesterolo che incapsula il nucleo di droga purificato della particella, sono state progettate. Il rivestimento monostrato lipidico è costituito da 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), colesterolo (Chol) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) insieme con il fluorescente etichetta DiI (rapporti molari di 43:50:5:2). Le nanoparticelle sono fabbricate utilizzando il metodo di iniezione rapida, che è una tecnica semplice e veloce per far precipitare le nanoparticelle di buono-solvente per lo scambio di anti-solvente. Si compone di un’iniezione rapida di una soluzione di etanolo contenente i componenti delle nanoparticelle in una fase acquosa. Le dimensioni delle nanoparticelle fluorescenti sono misurata mediante diffusione dinamica della luce (DLS) a 74,1 ± 6,7 nm. L’assorbimento delle nanoparticelle è testato in cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) e imaging utilizzando fluorescenza e microscopia confocale. L’assorbimento delle nanoparticelle è osservata in hMSCs, suggerente il potenziale per tale un sistema di consegna di droga stabile per falcarindiol.
Introduction
Nanoparticelle lipidiche rivestite stanno vedendo un crescente interesse per quanto riguarda la loro funzione come sistemi di drug delivery per cancro terapia1. Tumori hanno una riprogrammazione del lipido-metabolica alterata2 e una maggiore necessità di colesterolo a proliferare3. Essi dei overexpress LDLs1 e prendere in più LDLs rispetto alle cellule normali, nella misura in cui conte di LDL di un malato di cancro possono anche andare verso il basso4. L’assorbimento di LDL promuove fenotipi aggressivo5 conseguente proliferazione ed invasione nel seno cancro6. Un’abbondanza di recettori per le LDL (LDLRs) è un indicatore prognostico di potenziale metastatico7. Ispirato da LDL e relativo assorbimento dalle cellule tumorali, una nuova strategia è stata chiamata: rendere il farmaco simile cibo del cancro8. Così, questi nuove nanoparticelle droga consegna disegni8,9,10 sono stati ispirati dal design nucleo – e del lipido-stabilizzato del naturale LDLs11 come un meccanismo per la distribuzione di farmaci antitumorali alle cellule tumorali. Questo passivo consegna sistema di targeting supporta l’incapsulamento di, soprattutto, farmaci idrofobici, che di solito sono indicati nel modulo di dosaggio orale ma forniscono solo una piccola quantità di droghe nel flusso sanguigno, limitando così la loro efficacia attesa12. Come con i liposomi stealth13, un rivestimento di polietilene glicole (spina) aiuta a ridurre qualsiasi risposta immunologica ed estende la circolazione nel flusso sanguigno per assorbimento ottimale del tumore tramite la presunta maggiore permeazione ed effetto di ritegno (EPR) 14 , 15. Tuttavia, oltre a, in alcuni casi, l’instabilità nella circolazione e distribuzione indesiderabili nel sistema16, alcuni ostacoli rimangono irrisolti, come ad esempio come e in quale misura tali nanoparticelle sono prese dalle cellule e che cosa è loro destino intracellulare. È qui che questo libro affronta l’assorbimento delle nanoparticelle di un particolare farmaco anticancro idrofobo falcarindiol, utilizzando confocale ed epifluorescenza tecniche di imaging.
L’obiettivo dello studio è per fabbricare nanoparticelle lipidiche-rivestite di falcarindiol e di studiare il loro assorbimento intracellulare in hMSCs. Quindi, potenzialmente stabilizzando la sua amministrazione, superando le sfide connesse con la consegna e migliorando la biodisponibilità. Così valutare un nuovo sistema di consegna per questo farmaco anticancro. In precedenza, falcarindiol è stato amministrato oralmente tramite una falcarindiol alta concentrazione purificato come un cibo supplemento17. Tuttavia, c’è necessità di un approccio più strutturato fornire questo farmaco promettente. Di conseguenza, le nanoparticelle di falcarindiol, con fosfolipidi e colesterolo incapsulamento monostrato con la droga purificata che costituisce il nucleo della particella, sono state progettate. Il metodo di iniezione rapida di solvente spostando, come recentemente sviluppato da Needham et al. 8, viene utilizzato in questo studio per incapsulare il poliacetilene falcarindiol.
Il metodo è stato utilizzato in precedenza per la fabbricazione di nanoparticelle lipidiche per incapsulare diagnostica imaging agenti18,19, nonché di testare molecole (trioleina)27 e farmaci (orlistat, niclosamide stearato)8 ,27,28. È una tecnica relativamente semplice quando effettuate con le molecole di destra. Forma particelle di dimensioni nanometriche, al limite della loro critica nucleazione (~ 20 nm di diametro), di soluti idrofobi altamente insolubili disciolti in un solvente polare. Il cambio di solvente avviene mediante una rapida iniezione della soluzione organica in un eccesso di antisolvente (di solito, una fase acquosa in un organico di 1:9: rapporto volume acquoso)20,21.
Il disegno compositivo delle nanoparticelle danno luogo a molteplici vantaggi. I componenti di DSPC:Chol forniscono un monostrato molto stretto, quasi impermeabile, biocompatibile e biodegradabile. Il PEG fornisce un’interfaccia stericamente stabilizzante che agisce come uno scudo di opsonizzazione dal sistema immunitario, rallentando alcun assorbimento dal sistema reticoloendoteliale (fegato e milza) e protezione contro il sistema dei fagociti mononucleari, impedendo loro conservazione e degradazione dal sistema immunitario e quindi, aumentando la loro circolazione metà-tempo nel sangue22. Ciò permette che le particelle a circolare fino a quando essi MPEG al malato siti, quali i tumori, dove il sistema vascolare è che perde, permettendo EPR-effetto dare origine a accumulazione passiva delle particelle. Inoltre, il mantello lipidico permette di avere un migliore controllo sulle dimensioni dei nanoparticelle intrappolando cineticamente il nucleo al suo nucleo fondamentale dimensione27,28. Lipidi inducono varie proprietà della superficie (tra cui peptide di targeting, che non era ancora disponibile per questo progetto), un nucleo di droga pura e un basso polidispersità22,27,28. Il metodo utilizzato per analisi granulometrica è DLS, una tecnica che permette ai ricercatori di misurare le dimensioni di un gran numero di particelle allo stesso tempo. Tuttavia, questo metodo può polarizzare le misurazioni di dimensioni maggiori, se le nanoparticelle non sono monodispersed23. Questo problema è valutato con il mantello lipidico pure. Maggiori dettagli di questi disegni fondamentali e la quantificazione di tutte le caratteristiche sono date in altre pubblicazioni27,28.
Il farmaco incapsulato in nanoparticelle è falcarindiol, un dietetico poliacetilene trovati in piante della famiglia delle Apiaceae. È un metabolita secondario dal alifatici C17poliacetileni tipo che è stato trovato per visualizzare gli effetti di promozione della salute, compreso attività antinfiammatoria, effetti antibatterici e citotossicità contro una vasta gamma di linee cellulari del cancro. Sua alta reattività è relativo alla sua capacità di interagire con diverse biomolecole, che agisce come un agente alchilante molto reattivo contro mercapto e gruppi amminici24. Falcarindiol precedentemente è stato indicato per ridurre il numero di lesioni neoplastiche nei due punti17,25, anche se i meccanismi biologici sono ancora sconosciuti. Tuttavia, è pensiero che interagisce con biomolecole quali NF-κB, COX1, COX-2, e citochine, inibendo il loro tumore progressione e cellula proliferazione processi, che portano ad arrestare il ciclo cellulare, reticolo endoplasmico (ER) lo stress e l’apoptosi 17,26 in cellule tumorali. Falcarindiol viene utilizzato in questo studio come farmaco anticancro esempio grazie al suo potenziale anticancro e il meccanismo sono attualmente in fase di studio, e perché dimostra gli effetti anticancro di promessa. L’assorbimento cellulare delle nanoparticelle è testato in hMSCs e imaging utilizzando epifluorescenza e microscopia confocale. Questo tipo di cella è stato scelto per via delle sue dimensioni, che li rende ideali per microscopia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocollo dettagliato per la realizzazione di nanoparticelle lipidiche-rivestite per il drug delivery con il semplice, metodo di iniezione rapida veloce, riproducibile e scalabile di solvente spostando era seguita27,28 e viene presentato in questa carta, come applicato a falcarindiol. Controllando la velocità dell’iniezione della fase organica in fase acquosa e utilizzando i lipidi rivestimento a concentrazioni appropriate per rivestire il nucleo di falcarin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Moustapha Kassem (Odense University Hospital, Danimarca) per le cellule staminali mesenchimali umane. Gli autori ringraziano il centro di Bioimmagini del medico danese per l’accesso ai loro microscopi. Gli autori ringraziano i fondamenti di Carlsberg e Villum sostegno finanziario (per E.A.C.). Gli autori riconoscono il sostegno finanziario fornito dal premio Niels Bohr cattedra dalla Danish National Research Foundation.
Materials
| 12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm) | Microlab Aarhus A/S | ML 33154LP | |
| 6 well plates | Greiner Bio One International GmbH | 657160 | |
| Absolute Ethanol | EMD Millipore (VWR) | EM8.18760.1000 | |
| Chloroform | Rathburn Chemicals Ltd. | RH1009 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | |
| Confocal Microscope | Zeiss LSM510 | ||
| Cover Slips thickness #1.5 | Paul Marienfeld GmbH & Co | 117650 | |
| Desiccator | Self-build | ||
| DiI | Invitrogen | D282 | |
| DLS | Beckman Coulter | DelsaMAXpro 3167-DMP | |
| DSPC (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850365C | |
| DSPE PEG 2000 (Chloroform stock) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 880120C | |
| eVol XR | SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. | 2910200 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| Fluorescence Miccroscope | Olymous IX81 | With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD | |
| Incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Magnetic flea | VWR Chemicals | 15 x 4.5 mm | Cylindrical shape with PTFE coating |
| Magnetic stirrer | IKA | RT-10 | |
| Minimum Essential Media | Gibco | 32561-029 | |
| PBS tablets for cell culture | VWR Chemicals | 97062-732 | |
| Pen/strep | VWR Chemicals | 97063-708 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4) | Thermo Fisher | 10010031 | |
| Rotary Evaporator | Rotavapor, Büchi Labortechnik AG | R-210 | |
| Sample concentrator | Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC | SBHCONC/1 |
References
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