डबल-असहाय आरएनए और पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स की फोकल इमेजिंग में नकारात्मक-भावना आरएनए वायरस संक्रमण
Summary
डबल-कतरा आरएनए के दौरान उत्पादित आरएनए वायरस प्रतिकृति पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा पहचाना जा सकता है एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए. नकारात्मक-भाव आरएनए वायरस के लिए, निम्न स्तर के dsRNA और PRRs के बीच बातचीत अस्पष्ट बनी हुई है । हम व्यक्तिगत कोशिकाओं में arenavirus dsRNA और पीआरआर कल्पना करने के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोपी विधि विकसित की है ।
Abstract
डबल असहाय (डी एस) आरएनए एक प्रतिकृति मध्यवर्ती आरएनए वायरस संक्रमण के दौरान के रूप में उत्पादित है । मेजबान पैटर्न मांयता रिसेप्टर्स (PRRs) जैसे retinoic एसिड (रिग-मैं) रिसेप्टर्स (RLRs) रिग-मैं और मेलेनोमा भेदभाव-जुड़े प्रोटीन 5 (एमडीए-5) की तरह द्वारा dsRNA की मांयता जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रेरण की ओर जाता है । सकारात्मक-अर्थ आरएनए वायरस संक्रमण में dsRNA के गठन और intracellular वितरण को सूक्ष्मता से अच्छी तरह से पहचाना गया है । कई नकारात्मक-भावना आरएनए वायरस, कुछ arenaviruses सहित, संक्रमण के दौरान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर. हालांकि, नकारात्मक भावना आरएनए वायरस dsRNA के निम्न स्तर का उत्पादन करने के लिए सोचा गया था, जो वायरल dsRNA की पीआरआर मान्यता के इमेजिंग अध्ययन में बाधा. साथ ही, अत्यधिक रोगजनक arenaviruses के साथ संक्रमण प्रयोगों उच्च नियंत्रण में किया जाना चाहिए-सुरक्षा स्तर की सुविधाओं (बीएसएल-4) । उच्च रोगजनक आरएनए वायरस के लिए वायरल आरएनए और PRRs के बीच बातचीत मुख्यतः अतिरिक्त तकनीकी चुनौतियों के कारण अज्ञात है जो शोधकर्ताओं को बीएसएल-4 सुविधाओं में सामना करने की आवश्यकता है । हाल ही में, एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) (क्लोन 9D5) मूल रूप से पैन के लिए इस्तेमाल किया enterovirus पता लगाने के लिए विशेष रूप से पारंपरिक dsRNA या J2 विरोधी K1 एंटीबॉडी की तुलना में एक उच्च संवेदनशीलता के साथ dsRNA का पता लगाने के लिए पाया गया है । इस के साथ साथ, 9D5 एंटीबॉडी का उपयोग करके, हम एक फोकल माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है dsRNA, वायरल प्रोटीन और एक साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं में पीआरआर arenavirus से संक्रमित कल्पना का वर्णन । प्रोटोकॉल भी BSL4 सुविधाओं में रोगजनक arenavirus संक्रमित कोशिकाओं में dsRNA और पीआरआर वितरण के इमेजिंग अध्ययनों के लिए उपयुक्त है ।
Introduction
सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रेरण के प्रारंभिक कदम के पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) जैसे retinoic एसिड (रिग-मैं) रिसेप्टर्स (RLRs) रिग की तरह द्वारा डबल-कतरा (डी एस) आरएनए के मेजबान मान्यता है-मैं और मेलेनोमा भेदभाव से जुड़े प्रोटीन 5 (एमडीएस-5)1. सकारात्मक भावना आरएनए वायरस के लिए, dsRNA आमतौर पर J2 या K1 विरोधी dsRNA मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब)2का उपयोग कर आसानी से पता लगाया जा सकता है । इस तरह के picornavirus के रूप में सकारात्मक-किनारा आरएनए वायरस, में dsRNA और PRRs के बीच बातचीत, फोकल माइक्रोस्कोपी3का उपयोग कर विशेषता है । हालांकि, के लिए नकारात्मक अर्थ आरएनए वायरस, दृश्य और पीआरआर और dsRNA बातचीत के लक्षण वर्णन dsRNA के लिए संवेदनशील एंटीबॉडी की कमी से बाधा गया है. सीटू संकरण (मछली) में आरएनए फ्लोरोसेंट वायरल आरएनए और PRRs4के दृश्य के लिए लागू किया गया है । फिर भी, मछली पद्धति लक्ष्य आरएनए अनुक्रम के ज्ञान की आवश्यकता है और पीआरआर सह धुंधला के साथ संगत नहीं हो सकता है । हाल ही में, 9D5 मॉब, जो मूल रूप से पैन-enterovirus संक्रमण के निदान के लिए विकसित किया गया था, J2 मॉब से अधिक संवेदनशील पाया गया था और आसानी से नकारात्मक-भाव आरएनए वायरस संक्रमण5,6में dsRNA का पता लगा सकते हैं । इस प्रकार, मॉब 9D5 वायरल प्रतिकृति और नकारात्मक भावना आरएनए वायरस के लिए पीआरआर और वायरल आरएनए के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपंयास और उपयोगी उपकरण है ।
Arenaviruses के एक परिवार के एकल-असहाय, नकारात्मक भावना आरएनए वायरस, जो कई मानव रोगजनकों शामिल हैं, जैसे लासॅ वायरस (LASV), Junín वायरस (JUNV) और Machupo वायरस (MACV), कि मानव में गंभीर रक्तस्रावी बुखार रोगों के कारण7. अर्जेण्टीनी रक्तस्रावी बुखार के गंभीर और घातक मामलों से नैदानिक डेटा नई दुनिया arenavirus JUNV सीरम IFN के असामांय रूप से उच्च स्तर के प्रदर्शन की वजह से-α8,9। हमें पता चला है कि रोगजनक arenaviruses (JUNV और MACV), लेकिन रोगजनक पुरानी दुनिया arenavirus, LASV, मानव इंटरफेरॉन में एक प्रकार मैं IFN (monocyte) प्रतिक्रिया प्रेरित-वृक्ष कोशिकाओं10व्युत्पंन । इसके अलावा, रिग-मैं JUNV-संक्रमित कोशिकाओं11में प्रकार मैं IFN प्रतिक्रिया मध्यस्थता सेंसरों में से एक है. हमने यह भी पाया कि प्रोटीन कळेनासे आर (PKR) रिसेप्टर, जो परंपरागत रूप से dsRNA मांयता के लिए जाना जाता है, रोगजनक arenavirus12संक्रमण में सक्रिय है । arenavirus संक्रमण के दौरान वायरस विशिष्ट IFN प्रतिक्रिया के तंत्र को समझने के लिए, हम वायरल dsRNA और cytoplasmic PRRs के बीच बातचीत की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने के उद्देश्य से ।
रोगजनक JUNV, MACV और LASV के साथ संक्रमण प्रयोगों के लिए सुरक्षा स्तर 4 (बीएसएल-4) सुविधाओं में किया जाना है । इस प्रकार, arenavirus संक्रमण में गठित dsRNA के संभवतः निम्न स्तर के अलावा, इन अत्यधिक रोगजनक विषाणुओं के लिए इमेजिंग अध्ययनों के प्रदर्शन के दौरान, सुरक्षा आवश्यकताओं को पूरा करना एक और तकनीक चुनौती है । 9D5 एंटीबॉडी और JUNV के Candid1 # वैक्सीन तनाव का उपयोग करके, एक फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित प्रोटोकॉल इस रिपोर्ट में वर्णित है, जो सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है dsRNA, वायरल प्रोटीन और पीआरआर में arenavirus से संक्रमित कोशिकाओं में एक साथ कल्पना करने के लिए BSL2 लैब्स । प्रोटोकॉल भी BSL4 सुविधाओं में रोगजनक arenavirus संक्रमण के दौरान dsRNA और पीआरआर के intracellular वितरण के दृश्य के लिए उपयुक्त है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सकारात्मक भावना आरएनए वायरस और dsDNA वायरस के लिए, dsRNA व्यापक रूप से इस्तेमाल किया J2 विरोधी dsRNA एंटीबॉडी के साथ आसानी से पता चला है । हालांकि, नकारात्मक-भावना आरएनए वायरस एक ही एंटीबॉडी2का उपयोग कर पत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम UTMB इमेजिंग कोर सुविधाओं और माइक्रोस्कोप सहायता के लिए मैक्सिम Ivannikov शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
इस कार्य को जन स्वास्थ्य सेवा अनुदान RO1AI093445 द्वारा समर्थित किया गया और RO1AI129198 को एसपी, UTMB वचनबद्धता निधि P84373 को चौधरी, और T32 AI007526 को उन्हें सम्मानित किया गया.
Materials
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6 (2006).
- Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
- Onomoto, K., et al. Critical role of an antiviral stress granule containing RIG-I and PKR in viral detection and innate immunity. PLoS One. 7, e43031 (2012).
- Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. Double-stranded RNA is detected by immunofluorescence analysis in RNA and DNA virus infections, including those by negative-sense RNA viruses. Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).
- Mateer, E. J., Paessler, S., Huang, C. Visualization of double-stranded RNA colocalizing with pattern recognition receptors in arenavirus infected cells. Frontiers Cellular and Infection Microbiology. 8, 251 (2018).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Arenavirdae: The viruses and their replication. Fields Virology. 2, (2006).
- Levis, S. C., et al. Endogenous interferon in Argentine hemorrhagic fever. The Journal of Infectious Diseases. 149, 428-433 (1984).
- Levis, S. C., et al. Correlation between endogenous interferon and the clinical evolution of patients with Argentine hemorrhagic fever. Journal of Interferon Research. 5, 383-389 (1985).
- Huang, C., et al. Highly pathogenic new world and old world human arenaviruses induce distinct interferon response in human cells. Journal of Virology. 89, 7079-7088 (2015).
- Huang, C., et al. Junin virus infection activates the type I interferon pathway in a RIG-I-dependent manner. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1659 (2012).
- Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20 (2017).
- Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
- Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6 (2018).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
