Proyección de imagen confocal de ARN bicatenario y receptores de reconocimiento de patrón en la infección por Virus de ARN de sentido negativo
Summary
RNA de doble hebra producido durante la replicación de virus de ARN puede ser reconocido por los receptores de reconocimiento de patrón para inducir una respuesta inmune innata. Virus de ARN de sentido negativo, la interacción entre el bajo nivel dsARN y PRRs sigue siendo confusa. Hemos desarrollado un método de microscopia confocal para visualizar arenavirus dsARN y PRR en células individuales.
Abstract
(Ds) RNA de doble cadena se produce como un intermediario replicativo durante la infección de virus de ARN. Reconocimiento de dsRNA por receptores de reconocimiento de patrón host (PRRs) como el ácido retinoico (RIG-I) como receptores (RLRs) RIG-I y melanoma proteína asociada a la diferenciación 5 (MDA-5) conduce a la inducción de la respuesta inmune innata. La formación y la distribución intracelular de dsARN en infección por virus de ARN de sentido positivo se ha caracterizado bien por microscopía. Muchos virus de ARN de sentido negativo, incluyendo algunos arenavirus, desencadenan la respuesta inmunitaria innata durante la infección. Sin embargo, los virus de ARN de sentido negativo pensaron para producir niveles bajos de dsRNA, que dificulta el estudio de reconocimiento de la PRR de dsRNA viral. Además, los experimentos de infección con el virus altamente patógeno deben realizarse en instalaciones de nivel de seguridad de la biotecnología de alta contención (BSL-4). La interacción entre virus ARN y PRRs para el altamente patógeno virus de ARN es desconocida debido a los desafíos técnicos adicionales que necesitan los investigadores para enfrentar en las instalaciones del BSL-4. Recientemente, un anticuerpo monoclonal (Mab) (clon 9 5) originalmente utilizado para la detección de enterovirus de pan se ha encontrado para detectar específicamente dsRNA con una sensibilidad mayor que los anticuerpos de anti-dsRNA tradicionales J2 o K1. En el presente, mediante la utilización de la 5 9 anticuerpos, se describe un protocolo de microscopía confocal que se ha utilizado con éxito para visualizar dsRNA, proteína viral y PRR simultáneamente en células individuales infectadas por arenavirus. El protocolo también es adecuado para estudios de dsARN y distribución de PRR en arenavirus patógenos infectadas células en BL4 instalaciones de imagen.
Introduction
El paso inicial de la inducción de la respuesta inmune innata es reconocimiento del hospedero de doble cadena (ds) RNA por los receptores de reconocimiento de patrón (PRRs) como el ácido retinoico (RIG-I) como receptores (RLRs) RIG-I y melanoma asociado a diferenciación proteína 5 (MDA-5)1. Para virus de ARN de sentido positivo, dsRNA puede generalmente ser detectado fácilmente utilizando el J2 o K1 dsARN anti anticuerpos monoclonales (Mab)2. Interacción entre dsARN y PRRs en virus de ARN de cadena positiva, como picornavirus, se ha caracterizado mediante microscopía confocal3. Sin embargo, para virus de ARN de sentido negativo, visualización y caracterización de la interacción PRR y dsRNA ha sido obstaculizado por la falta de anticuerpos sensibles al dsRNA. Hibridación in situ fluorescente (FISH) de RNA se ha aplicado a la visualización de viral RNA y PRRs4. Sin embargo, la metodología de peces requiere el conocimiento de la blanco de secuencia de ARN y puede no ser compatible con PRR Co la coloración. Recientemente, el 5 de 9 Mab, que originalmente fue desarrollado para el diagnóstico de la infección del enterovirus pan, fue encontrado para ser más sensible que el Mab de J2 y puede fácilmente detectar dsARN en sentido negativo RNA virus infección5,6. Así, Mab 5 9 es una novedosa y útil herramienta para estudiar la replicación viral y la interacción entre PRR y el ARN viral para virus de ARN de sentido negativo.
Arenavirus son una familia de virus de ARN monocatenario, de sentido negativo, que incluyen varios patógenos humanos, tales como virus de Lassa (LASV), virus Junín (JUNV) y el virus de Machupo (MACV), que causan enfermedades de fiebre hemorrágica severa en seres humanos7. Datos clínicos de casos graves y fatales de Argentina fiebre hemorrágica causada por el arenavirus del nuevo mundo JUNV exhiben niveles inusualmente altos de suero IFN-α8,9. Hemos demostrado que los arenavirus patógenos del NW (JUNV y MACV), pero no el patógeno viejo mundo arenavirus, LASV, inducir a un tipo respuesta al interferón (IFN) en células dendríticas derivadas de monocitos humanos10. Además, la plataforma-es uno de los sensores mediación tipo I respuesta IFN en células infectadas con JUNV11. También se encontró que la proteína quinasa R (PKR) del receptor, que es tradicionalmente conocido por reconocimiento de dsRNA, está activado en patógenos NW arenavirus infección12. Para entender aún más el mecanismo de la respuesta IFN de virus-específica durante la infección por arenavirus, el objetivo fue desarrollar un protocolo para visualizar la interacción entre el dsRNA viral y el PRRs citoplásmicos.
Experimentos de infección con patógenos JUNV, MACV y LASV tienen que realizarse en bioseguridad nivel 4 (BSL-4) instalaciones. Así, además el presumiblemente bajo nivel de dsARN en infección por arenavirus, cumpliendo con los requisitos de seguridad de la biotecnología es otro desafío de la técnica al realizar estudios por imágenes para estos virus altamente patógenos. Mediante la utilización de la 5 9 anticuerpos y la cepa vacunal Candid1 # de JUNV, un protocolo basado en la microscopía confocal se describe en este informe, que se ha utilizado con éxito para visualizar dsRNA, proteína viral y PRR simultáneamente en células infectadas por arenavirus en Laboratorios BSL2. El protocolo también es adecuado para la visualización de la distribución intracelular de dsARN y PRR durante infección por arenavirus patógenos en instalaciones BL4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virus de ARN de sentido positivo y virus dsDNA, dsRNA se detecta fácilmente con el anticuerpo de anti-dsRNA J2 ampliamente utilizado. Sin embargo, los virus de ARN de sentido negativo se creen para producir dsRNA en un bajo o por debajo del nivel de detección utilizando el mismo anticuerpo2. Así, muchos aspectos de la interacción viral de RNA y PRR son en gran parte confusos para los virus de ARN de sentido negativo. Hemos intentado manchar de dsARN en infección por arenavirus usando el antic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a las instalaciones de base imagen UTMB y Maxim Ivannikov ayuda de microscopio.
Este trabajo fue financiado por el servicio de salud pública concesión de RO1AI093445 y RO1AI129198 otorgado a SP, UTMB compromiso fondo P84373 CH y AI007526 T32 a EM.
Materials
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
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