Summary

分離と養子伝高塩処理樹状細胞の抗原提示

Published: March 05, 2019
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Summary

ここでは、磁気細胞選別と素朴なマウスにそれに続く養子転送によるマウス脾臓から樹状細胞を分離するためのプロトコルを提案する.高食塩活性化樹状細胞のモデルは、養子の転送とフローサイトメトリーのステップバイ ステップの手順を説明するのに選ばれました。

Abstract

過剰な塩分摂取は炎症に寄与し、高血圧の開発に重要な役割を果たしています。以前抗原提示樹状細胞 (Dc) が NADPH オキシダーゼの活性化と isolevuglandin (IsoLG) の形成につながる高架の細胞外ナトリウムを感じることができることがわかった-付加体のタンパク質。これらの IsoLG 蛋白質は自己蛋白質と反応を内転、自己免疫のような状態と高血圧を促進します。我々 は開発し、最適化方法高血圧症における DC 機能を勉強します。ここでは、我々 はの分離、詳細なプロトコルを提供体外照射高ナトリウムとマウスの脾 CD11c の養子転送受信者マウス高血圧におけるそれらの役割を研究するために細胞の+

Introduction

塩分は、高血圧のための主要な危険因子です。1,2米国心臓協会推奨 2,300 ミリグラム (mg) 1 日あたりのナトリウム (Na+) 摂取量の最大値。米国の人口の 10% 未満の場合は、この勧告を遵守します。3,4 + Na 摂取量の適度な削減血圧を下げるし、冠動脈心疾患と米国で脳卒中の年次の新しいケースを 20% 削減します。5余分な塩の消費の主な問題は、高血圧の人口の 50% が塩感受性を表わすこと後ナ+ロードや血圧のような低下血圧で 10 mmHg 増加として定義されている +制限と利尿。6塩感度は、また、正常血圧の個人の 25% で発生し、死と心血管イベントの独立した予測因子は。7,8高血圧腎臓を含む塩センシング機構がよく研究されて;ただし、最近の研究は、免疫細胞が Na+を感じることができることをお勧めします。9,10

最近の証拠は、外腎 Na+で変更処理が間に Na+の蓄積を引き起こすでき、炎症を促進するを示唆しています。11,12当研究室および他示されている自然免疫と適応免疫システムの両方の細胞が高血圧の悪化に貢献します。9,13,14,15さまざまな高血圧の刺激は、アンジオテンシン II、ノルエピネフリンおよび原因になる食塩マクロファージ、単球、腎臓と血管系に潜入し、Na+保存、血管収縮、血圧を促進する T リンパ球を含む標高と終末器官損傷。9,16,17,18,19,20は先行研究で我々 は isolevuglandin (IsoLG) を Dc に蓄積を発見-アンジオテンシン II、DOCA-塩高血圧症を含む様々 な高血圧性刺激に対する応答における付加体のタンパク質。14 IsoLGs 蛋白質のリジン付加物と急速に脂質過酸化反応の反応性の高い製品、その蓄積が DC の活性化に関連付けられています。14高 Na+は IsoLG 蛋白質のための強力な刺激を設けて最近は Dc に dc9+エントリはアミロライド敏感なトランスポーターを介したマウスにおける付加物します。Na+は、カルシウム (Ca2 +) Na+/Ca2 +交換器を介して交換されます。Ca2 +活性化プロテインキナーゼ C (PKC) 増加した活性酸素 (O2· –) につながる NADPH オキシダーゼの活性化し、IsoLG 蛋白質付加物生成。9養子伝アンギオテンシン II のサブ昇圧線量への応答での Dc 素数の高血圧の塩公開します。9

CD11c の識別+ Dc 組織からは免疫組織および RT-PCR に以前制限されています、Dc の分離は、細胞のフローサイトメトリーによる並べ替えに制限されています。流れ cytometry セルソートは免疫細胞の隔離のための強力な方法が、それはコストがかかり、時間がかかりと実行可能なセルの低収量に 。したがって、我々 は組織の消化、体外刺激 CD11c の養子の転送のためのステップ バイ ステップ プロトコルを最適化してきました+ Dc 高血圧を研究します。

Protocol

ヴァンダービルト大学の制度的動物ケアおよび使用委員会は、本明細書に記載されている手順を承認しました。マウスが建物し、の世話をガイドに従ってケアおよび実験動物の使用 (国民アカデミーの出版物。改訂 2010 年)。 1. マウスから脾臓の単離 RPMI 1640 の準備: 10 s、0.10 mM HEPES 1 mM ピルビン酸ナトリウム 50 μ M β-メルカプトエタノール、1% ペニシリン/ストレ…

Representative Results

図 1は、上記説明の手順の概略を表します。CD11c の孤立したマウス脾臓を並べ+磁気細胞 48 h. CD11c の通常の塩メディア (NS; 150 モル塩化ナトリウム) または高い塩メディア (HS; 190 ミリ モル塩化ナトリウム) でメッキを並び替えで Dc+の Dc に対してレトロ軌道によって転送されるし、素朴な受信者マウスに注入。10 日後、マウスは 14 ?…

Discussion

CD11c を分離する手順を最適化プロトコルでは、現在、+の Dc に対してマウスの脾臓から塩高血圧で Dc の役割を研究する素朴な動物にそれらを転送します。このプロトコルは、分離し、マクロファージ、単球、T および B リンパ球を含む適応免疫細胞など他の免疫細胞のサブセットを転送利用に適応できます。我々 は十分な細胞生存率と DC 表面発現マーカーの安定性を達成するために?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業によって支えられたアメリカ心臓協会は、N.R.B. に POST290900 を付与、L.X.、国立衛生研究所の 17SDG33670829 A.K. に K01HL130497 を付与

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c Biolegend 117324
autoMACS Running Buffer  Miltenyi Biotec 130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure  Miltenyi Biotec 130-108-338
Collagenase D Roche 11088866001
DNase I Roche 10104159001
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec  130-092-575
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
GentleMACS C tube Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Invitrogen L34964
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACs Seperator  Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 medium  Gibco 11835-030

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Citer Cet Article
Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (145), e59124, doi:10.3791/59124 (2019).

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