Summary

בידוד והעברה המאמצת של מלח גבוהה מטופלים אנטיגן תאים דנדריטים

Published: March 05, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד תאים דנדריטים טחולים מאתר על ידי מיון מגנטי תא עוקבות המאמצת העברת לתוך תמים עכברים. המודל של תאים דנדריטים מופעל מלח גבוהה נבחר להסביר את ההליכים צעד אחר צעד של cytometry זרימה והעברת המאמצת.

Abstract

עודף צריכת המלח תזונתיים תורמת דלקת ואת ממלא תפקיד חיוני בהתפתחות של יתר לחץ דם. קודם לכן מצאנו כי אנטיגן תאים דנדריטים (Dc) יכול לחוש נתרן גבוהות חוץ-תאית, המוביל את ההפעלה של אוקסידאז nadph ל היווצרות של isolevuglandin (IsoLG)-חלבון adducts. אלה IsoLG-חלבון adducts מגיבים עם עצמי-חלבונים ולקדם אוטואימונית כמו המדינה ויתר לחץ דם. יש שפותחה ואנו ממוטב המדינה-of-the-art שיטות ללמוד הפונקציה DC ביתר לחץ דם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד, ב- חוץ גופית הטיפול עם נתרן גבוהות, והעברה המאמצת של הטחול מאתר CD11c+ תאים לתוך עכברים הנמען ללמוד את תפקידם של יתר לחץ דם.

Introduction

עודף מלח תזונה הוא גורם סיכון עיקרי עבור יתר לחץ דם. 1 , 2 American Heart Association ממליץ 2,300 מיליגרם (מ ג) של צריכת נתרן (Na+) ליום, לכל היותר פחות מ-10% מאוכלוסיית ארה ב מתבונן המלצה זו. 3 , 4 צנוע הפחתות צריכת Na+ להוריד את לחץ הדם, לצמצם את המקרים החדשים השנתי של מחלת לב כלילית, קו בארה ב 20%. 5 בעיה רצינית עם עודף צריכת מלח הוא כי 50% מהאוכלוסיה עם יתר לחץ דם תערוכות מלח-רגישות, כהגדרתו העלאה של 10 מ מ כספית בלחץ הדם בעקבות Na+ טעינה או ירידה דומה בלחץ הדם לאחר Na+ ההגבלה ו diuresis. 6 מלח-רגישות גם מתרחשת ב- 25% של אנשים normotensive, חזאי עצמאית של מוות ושל אירועי לב וכלי דם. 7 , 8 מנגנוני חישה מלח יתר לחץ דם המערבים את הכליה. ובכן נחקרו; אולם, מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי תאי המערכת החיסונית יכולה לחוש Na+. 9 , 10

ממצאים אחרונים מעידים כי השינויים במיוחד כליות נה+ טיפול יכול לגרום להצטברות של Na+ interstitium ולקדם דלקת. 11 , 12 מעבדה שלנו ואחרים הראו כי תאים של שני מולדת, מסתגלת המערכת החיסונית לתרום החרפה של יתר לחץ דם. 9 , 13 , 14 , 15 שונים לחץ דם גבוהה לגירויים, כולל אנגיוטנסין II, נוראדרנלין, כי מלח מקרופאגים, ומונוציטים ו- T לימפוציטים לחדור את הכליות ואת להערכת ולקידום השמירה Na+ , vasoconstriction, לחץ דם העלאת ונזק סוף-איברים. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 במחקרים קודמים, מצאנו כי DCs להצטבר isolevuglandin (IsoLG)-חלבון adducts בתגובה לגירויים שונים עם יתר לחץ דם, לרבות אנגיוטנסין II ו- DOCA-מלח יתר לחץ דם. 14 IsoLGs מוצרים מאוד תגובתי של השומנים peroxidation במהירות, covalently adduct כדי lysines על חלבונים, הצטברות שלהם קשורה DC הפעלה. 14 הקמנו לאחרונה כי מוגברות Na+ הוא גירוי חזק עבור IsoLG-חלבון adduct-צורה מאתר Dc-9 Na+ כניסתו DCs מתווך באמצעות מובילי רגיש amiloride. נה+ ואז חילופי לקבלת סידן (Ca2 +) דרך בכל הארץ, ד2 + מחליף נה+. Ca2 + מפעיל קינאז C (PKC) אשר מפעיל את אוקסידאז nadph ל המוביל סופראוקסיד מוגברת (O2· –), IsoLG-חלבון adduct גיבוש. 9 ההעברה המאמצת של מלח החשופים DCs הפריימים יתר לחץ דם בתגובה מנה תת pressor של אנגיוטנסין II. 9

זיהוי של CD11c+ DCs רקמות הוגבלה בעבר אימונוהיסטוכימיה, RT-PCR, בידוד של בקרי קבוצת מחשבים הוגבלה לתא מיון לפי cytometry זרימה. למרות cytometry זרימה מיון תא היא שיטה חזקה הבידוד של תאים חיסוניים, שזה יקר, זמן רב, מה שמוביל תשואה נמוכה של התאים קיימא. לכן, אנו יש אופטימיזציה פרוטוקול צעד אחר צעד עיכול רקמת, גירוי במבחנה של העברה המאמצת של CD11c+ DCs ללמוד ביתר לחץ דם.

Protocol

אוניברסיטת ואנדרבילט אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש אישרו ההליכים המתוארים במסמך זה. עכברים הם שוכנו, דאגו לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה (Press Academies הלאומית. 2010 המתוקן). 1. בידוד של טחולים של עכברים הכן 1640 RPMI: 10% FBS, 0.10 מ”מ HEPES, פירובט נתרן 1 מ מ, 50 מיקרומטר β-mercap…

Representative Results

איור 1 מייצג תיאור סכמטי של השלבים המתוארים לעיל. טחולים מאתר מבודד מסודרים עבור CD11c+ Dc לתא מגנטי ומיון מצופה מדיה מלח רגיל (NS; 150 mmol NaCl) או מדיה מלח גבוהה (HS; 190 mmol NaCl) עבור ה 48 CD11c+ DCs הם מכן הועבר adoptively על ידי רטרו-מסלולית הזרקה לעכברים הנמען תמים. עש?…

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי, לנו יש אופטימיזציה הליכים כדי לבודד CD11c+ DCs מ טחולים של עכברים, adoptively להעביר אותם לתוך תמים חיות ללמוד את התפקיד של בקרי קבוצת מחשבים במלח-induced יתר לחץ דם. פרוטוקול זה ניתן להתאים לבודד ולהעביר adoptively קבוצות משנה אחרים תא החיסון כולל מקרופאגים, ומונוציטים מסתגלת תאים ח…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי מעניק POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X., מכוני הבריאות הלאומיים להעניק K01HL130497 משום מקום

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c Biolegend 117324
autoMACS Running Buffer  Miltenyi Biotec 130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure  Miltenyi Biotec 130-108-338
Collagenase D Roche 11088866001
DNase I Roche 10104159001
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec  130-092-575
FITC anti-mouse CD45 Biolegend 103108
GentleMACS C tube Miltenyi Biotec 130-096-334
GentleMACS dissociator device Miltenyi Biotec 130-093-235 Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit Invitrogen L34964
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
QuadroMACs Seperator  Miltenyi Biotec 130-090-976
RPMI 1640 medium  Gibco 11835-030

References

  1. Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
  2. Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).
  3. Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
  4. Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
  5. He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).
  6. Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
  7. Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
  8. Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
  9. Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
  10. Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
  11. Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
  12. Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
  13. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
  14. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
  15. McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
  16. Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
  17. Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
  18. Harrison, D. G., et al. Inflammation, immunity, and hypertension. Hypertension. 57, 132-140 (2011).
  19. Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
  20. Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).

Play Video

Citer Cet Article
Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (145), e59124, doi:10.3791/59124 (2019).

View Video