Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier
Summary
Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’isoler les petites vésicules extracellulaires (EVs) de tissus entiers, y compris des échantillons de cerveau et la tumeur. Cette méthode offre une technique reproductible pour extraire les EVs de tissu plein pour approfondir les analyses en aval.
Abstract
Circulation et interstitielles petits extracellulaires vésicules membranaires (EVs) représentent des cibles prometteuses pour le développement de tests de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et pronostiques et probablement servent comme des acteurs importants dans la progression d’un vaste éventail de maladies. La recherche actuelle est axée sur la caractérisation des vésicules sécrétées par les cellules multiples et les types de tissus afin de mieux comprennent le rôle des véhicules électriques dans la pathogenèse de conditions, y compris la neurodégénérescence, l’inflammation et le cancer. Cependant, les techniques à l’échelle mondiale cohérentes et reproductibles pour isoler et purifier les vésicules demeurent en cours. En outre, méthodes d’extraction d’EVs de tissu solide ex vivo sont guère décrits. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour extraire l’EVs petits intérêt de tissus entiers frais ou congelés, y compris des échantillons de cerveau et tumeur, pour davantage de caractérisation. Nous avons démontré la capacité d’adaptation de cette méthode pour plusieurs analyses en aval, y compris la microscopie électronique et immunophénotypiques caractérisation des vésicules, ainsi que la spectrométrie de masse quantitative des protéines EV.
Introduction
Petites vésicules extracellulaires (EVs) incluent exosomes dérivés endosomale et petite membrane-hangar microvésicules qui sont d’intérêt biomédical en général. Petits EVs sont composées d’une population hétérogène de 50 à 250 nm membranaires vésicules contenant des protéines biologiquement actives, des lipides et des acides nucléiques qui sont censés collectivement jouent un rôle important dans une multitude de processus morbides. Faire avancer la recherche a impliqué notamment ces vésicules neurodégénératives et maladies à prions, processus infectieux, conditions autoimmunes ou inflammatoires et la croissance tumorale et métastase1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. essor de la recherche biomédicale dans la signification du SVE dans la pathogenèse de la maladie a suscité un intérêt parallèle à l’élaboration des méthodes reproductibles et rigoureux pour l’isolement et la purification de ces vésicules.
Un défi historique et actuel dans la caractérisation de l’EV a été l’incapacité de séparer entièrement petites sous-populations EV. Ce défi est en grande partie en raison de notre compréhension limitée des différents mécanismes moléculaires régissant la biogenèse des vésicules distinctes. Chevauchement de taille, densité et biologiques marchandises entre sous-populations plus matérielle de ces distinctions. Partie de ce défi a été également l’utilisation de différentes techniques d’enrichissement largement, offrant des incohérence dans l’analyse en aval de vésicules isolées dans les laboratoires et saper l’effort mondial visant à éclairer les populations EV catégoriques.
Il est à noter que la majorité des EV caractérisation a été effectuée de la collection in vitro de culture cellulaire surnageante, avec les plus récentes études in vivo, décrivant des techniques pour isoler les vésicules de sécrétions animales ou humaines, y compris plasma, urine et la salive. Alors que le serveur virtuel Exchange est présents en grande quantité en circulation, il est également reconnu que ces vésicules jouent un rôle important dans les événements de communication de cellule-cellule et sont présents dans l’interstitium des tissus cellulaires. Dans le contexte du cancer, EVs interstitielles peuvent être particulièrement importants dans la modulation du microenvironnement tumoral pour cellule cancéreuse semis et croissance métastatique14,15. Par conséquent, il y a valeur dans le développement et l’optimisation des techniques pour extraire des vésicules d’échantillons de tissus solides. Ces méthodes fournira un moyen d’étudier directement orgue – ou tumeur dérivée EVs récoltées à partir des échantillons cliniques, y compris les petites biopsies et résection partielle ou totale des organes.
Dans cette étude et dans un précédent rapport, publié par notre laboratoire16, nous avons pour objectif d’aborder plusieurs grandes préoccupations actuelles dans la méthodologie d’enrichissement EV : 1) pour décrire une technique reproductible pour isoler et purifier les EVs au plus haut niveau actuellement acceptée dans le domaine ; 2) pour tenter d’isoler les petites sous-populations EV fortement enrichies en dérivés endosomale exosomes ; et 3) de fournir un protocole pour l’extraction de ces vésicules provenant d’échantillons de tissu solide aux fins de la caractérisation plus loin.
Récemment, Kowal et collègues ont décrit un gradient de densité relativement petits iodixanol pour séparer et purifier les sous-populations EV avec une plus grande efficacité que saccharose comparables densité dégradés17. Dans l’étude citée, les EVs de culture cellulaire dendritiques capturés en une fraction de densité relativement légers, compatible avec une densité de 1,1 g/mL, ont été fortement enrichis en protéines endosomale censés être plus compatible avec une forte proportion des exosomes présent dans cette fraction. Selon les auteurs, ces protéines exosomal « bona fide » incluent gène de susceptibilité tumeur 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 et plusieurs annexin protéines17. Plus tard, nous avons adapté cette technique pour réussir une méthode de dissociation tissulaire décrite par Perez-Gonzalez et al.18 et un protocole de centrifugation différentielle suivantes pour isoler ensemble encéphales EVs16. Nous avons aussi démontré l’utilité de cette méthode pour la caractérisation des protéomes EV en combinant un protocole séquentiel pour la spectrométrie de masse quantitative et comparative en aval de protéine vésiculaire, déjà décrite par notre laboratoire19. Ce travail est parallèle à celle du laboratoire Hill, où EVs ont été enrichies du cortex frontal du cerveau20.
Dans cette étude, nous avons des précisions sur cette technique et étendre l’application du protocole a récemment publié dans notre laboratoire à l’isolement du SVE de tumeurs pulmonaires solide. À notre connaissance, c’est la première étude pour décrire un protocole afin d’enrichir les EVs d’ex vivo les échantillons de tumeur. Compte tenu de l’intérêt général suscité par EVs comme nouveaux biomarqueurs diagnostiques et leur rôle dans la tumorigenèse, cette méthode s’avérera sans doute précieuse pour un nombre croissant de chercheurs scientifiques. D’un point de vue clinique, EVs interstitielles pourraient abriter grande valeur diagnostique, en particulier dans les échantillons où évaluation histologique l’est limitée. Notre espoir est que la méthode décrite ici constituera un fondement pour une technique reproductible pour récolter des EVs des échantillons frais ou congelés animales ou humaines chirurgicales, ouvrant la voie à des travaux futurs découvrir le rôle important dans la pathogenèse de la maladie ces petites les vésicules peuvent jouer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intérêt scientifique s’est dégagé en ce qui concerne les rôles Qu’evs petits jouent dans le microenvironnement de la tumeur, ainsi que dans la fonction, la maturation et le développement de l’orgue. Dans l’ensemble, cette étude fournit un flux de travail optimisé pour l’extraction du SVE intact du cerveau entier ou les échantillons de tumeur. Alors qu’ici nous avons tout simplement démontrer l’applicabilité de cette technique au poumon dérivées de tumeurs SVE, cette méthode pourrait facilement ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Dr Richard Nowakowski et la Floride état Université laboratoire Animal ressources pour fournir et prendre soin des animaux utilisés afin d’élaborer ce protocole, respectueusement. Nous remercions Liu Xia, Dr Rakesh Singh et la Florida State University translationnelle Science Laboratory d’assistance avec le œuvre de spectrométrie de masse utilisée pour la caractérisation de la vésicule en aval, ainsi que la facilité aus Biological Sciences Imaging Resource l’utilisation du microscope électronique à transmission dans cette étude. Enfin, nous remercions le Dr Mandip Sachdeva (Florida A & M University) pour don des spécimens tumeur utilisés dans le développement de cette méthode. Cette étude a été financée par des subventions de la Floride ministère de la santé Ed et Ethel Moore Alzheimer maladie recherche programme attribué à D.G.M. et J.M.O (6AZ11) et le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous le numéro Award R01CA204621 attribué à D.G.M.
Materials
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
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