준비 및 Immunostaining Myelinating Organotypic 소 뇌 조각 문화
Summary
여기 우리 organotypic 슬라이스 문화 마우스 소 뇌 및 myelination와 중앙 신 경계에 remyelination의 메커니즘을 조사 적합 immunohistochemistry에 의해 얼룩 myelin 칼 집에서 준비 하는 방법을 제시.
Abstract
신 경계에서 수 초 이며 glial myelinating에 의해 생성 된 복잡 한 막 구조 세포, 어떤 ensheathes 축 삭 빠른 전기 전도 용이 하 게. Myelin 변경 어디 기능적인 적자와 관련 된 다양 한 신경 질환에 표시 되었습니다. 여기, 우리는 전직에 대 한 자세한 설명을 제공 vivo 모델 마우스 organotypic 소 뇌 조각, 여러 주 및 추가 표시 myelin를 시각화를 위한 문화에서 유지 될 수 있는 구성 된.
Introduction
신경 세포는 그것의 환경 및 생성 및 다른 세포에 전기 자극의 전파를 보장 하는 축 삭에서 입력을 받는 somato 수지상 구획을 구성 하는 매우 편광된 세포 이다. 빠른 전파와 정보의 적시 납품은 신경 시스템의 적절 한 작동에 대 한 필수적입니다. 척추 동물, 그것은 myelination axonal 전도 속도1증가 수에 의해 촉진 된다. Myelin 압축된 계층 myelinating 명과 의해 생성 된 플라즈마 멤브레인의 중앙 신경 조직 (CNS)에 즉 oligodendrocytes 및 Schwann 세포는 말 초 신 경계 (PNS)에 의해 형성 된 특수 구조 이다. CNS 그리고 PNS에서 둘 다, axoglial 상호 작용 드라이브 전문된 axonal 도메인의 형성: 노드의 Ranvier와 그들의 주변 도메인, paranodes, 및 juxtaparanodes2. 수 초, 또는 internodes, 전압 개폐 나트륨 채널 (Nav)에서 풍성 하 게 하는 작은 unmyelinated 도메인에 해당 하는 노드의 Ranvier와 대체 절연 axonal 세그먼트. 높은 농도 및 노드의 Ranvier에서 나v 채널의 급속 한 활성화 활동 전위 그리고 myelin 칼 집의 단 열 속성 함께 재생을 허용, 보장의 효율적이 고 빠른 saltatory 유도 따라3축 삭 신경 충 동입니다.
신경 임펄스의 전도 속도 가속에 그것의 역할, myelinating 명과 장기 무결성을 보존 하 고 그것의 생존4,5에 참여, 축 삭에 대사 지원을 합니다. 또한, 그것은 취소 되고있다에서 최근 몇 년 동안 그 myelin는 인생, 따라서 아마도 참가 규정 및 다양 한 신 경계 기능의가 소성을 통해 동적으로 변조. 배포, 숫자, 길이, 및 축 삭을 따라 myelin 덮개의 두께 따라서 다양 한 네트워크6,,78세밀 하 게 조정 하는 소설 방법을 나타낼 수 있습니다. 따라서, myelin의 진화 인수 감각, 모터 및 인지 기능에 대 한 핵심 프로세스 이며 축 삭과 명과 사이 상호 작용의 섭 동은 점점는 발달에 기여로 간주 또는 신경 인수 질병9.
지질 (70%)의 높은 비율의 특정 기능 myelin 구성 특징 되었습니다. 단백질 (30%)에 비해 달리 다른 세포 막10. 그러나, myelin 지질, 달리 myelin 단백질의 대부분은 myelin, myelin 기본적인 단백질 (MBP), proteolipid 단백질 (PLP), 2′, 3′-주기적인 뉴클레오티드 3′-포스 (CNP), myelin 연합 당단백질 (MAG)를 포함 하 여 관련 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG), PMP-22 그리고 P010. Myelin 얼룩 다양 한 조직학 방법 존재 Luxol 빠른 블루11등의 지질 구성, 수단 블랙 B12, 베이커의 산 hematin 방법13로 실버14얼룩에 따라. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 방식을 적절 한 대비와 해상도 개별 섬유를 시각화를 위한 항상 허용 하지 않습니다. 수 초를 감지 하는 양자 택일 접근 immunohistochemistry myelin 단백질에 대 한 감독을 통해 이다. 다양 한 항 체는 높은 특이성으로 myelin 특정 항 원을 대상 고 myelinated 구조를 검출 하기 위하여 정기적으로 사용할 수 있습니다. 항 체 항 원 상호 작용은 1 차 항 체에 대 한 감독 및 적절 한 형광 현미경 검사 법으로 시각 fluorophore 결합 이차 항 체를 사용 하 여 추가 공개 수 있습니다. 여기, 우리는 토론 프로토콜 얼룩 myelin에 ex vivo 소 뇌 조각, 신경 조직 아키텍처의 좋은 보존 수 있는 모델을 설명 합니다. 또한, 조직 및 Purkinje 세포 (소 뇌의 유일한 myelinated 신경)의 크기 그들 electrophysiological 연구 클래식 모델 만들고 그들은 마찬가지로 고정 또는 라이브 이미징 연구를 수행 하기 위해 이상적입니다.
소 뇌 조각 Purkinje 세포 myelination, 비보 (6-7 일 생체 외에서, DIV)15전 1 주일에 의해 주로 달성 하는 과정의 초기 증상에 해당 하는 시간, P9-P10 생쥐에서 생성 됩니다. 또한,이 모델은 적응 demyelinating 질환 다 발성 경화 증 (MS) 등을 조사 하는 광범위 한 demyelination 또는 사용 하는 myelinotoxic 복합 lysophosphatidylcholine (lysolecithin, LPC), 소 뇌 조각에 유도 될 수 있다 어떤은 자발적인 remyelination16,17옵니다. 내 인 성 remyelination 문화 매체에서 LPC 제거 후 2 일에서 그리고 거의 주 게시물 치료 완료.
이 프로토콜의 완성 등 소 뇌 조각 문화 준비 demyelination의 피크에 도달 하는 2 일 뒤 완전히 myelinated 슬라이스를 주, 그들의 전체에 대 한 다른 주에 대 한 반나절 approximatively 3 주 소요 remyelination입니다. 또한, immunohistochemistry 2 일 이내에 완료할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 6 쥐 새끼의 표준 쓰레기에 적응 그리고 계획 된 실험에 사용 되는 동물의 수에 적응 시킬 필요가 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 전을 생성 하는 프로토콜 세부 vivo 모델 마우스 소 뇌 organotypic 슬라이스 문화에 해당 게시 방법15,,1619 및 후속 myelin 이전에서 적응 이러한 준비의 immunostaining입니다. 이 전략 모두 건강 하 고 병 적인 상태에는 고해상도와 수 초 구성 요소를 시각화 하는 가능성을 제공 합니다.
10 일 된 쥐에서 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리에 대 한 귀중 한 의견 원고 박사 숀 프리먼, 닥터 나탈리 솔-Foulon와 박사 토마스 루 감사합니다. 이 작품 INSERM, ICM, ARSEP 교부 금 R13123DD, ANR R17127DD (광고)에 FRM 친목, SPF20110421435 (광고)에 의해 투자 되었다 (몬태나)를 FDT20170437332. 우리는 icm CELIS 셀 문화 시설 감사합니다. 양의 이미징 플랫폼입니다.
Materials
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 x 26 x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
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