Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen
Summary
Hier präsentieren wir eine Methode um organotypischen Slice Kulturen aus Maus Kleinhirn und Myelinscheide Färbung von Immunohistochemistry geeignet für die Untersuchung von Mechanismen der Myelinisierung und Remyelinisierung in das zentrale Nervensystem vorzubereiten.
Abstract
Im Nervensystem ist Myelin eine komplexe Membranstruktur erzeugte Myelinating glial Zellen, welche Ensheathes Axone und erleichtert die schnelle elektrische Leitfähigkeit. Myelin Veränderung nachweislich bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen auftreten, wo sie funktionelle Defizite zugeordnet ist. Hier bieten wir eine ausführliche Beschreibung der Ex Vivo Modell bestehend aus Maus organotypischen zerebelläre Scheiben, die in Kultur gepflegt werden können, für mehrere Wochen und weiter beschriftet werden, um Myelin zu visualisieren.
Introduction
Neuronen sind stark polarisierten Zellen, die eine Somato-dendritische Fach umfassen, die erhält Eingänge von seiner Umgebung und ein Axon, das die Erzeugung und Ausbreitung der elektrischen Impulse an andere Zellen sicherstellt. Schnelle Ausbreitung und rechtzeitige Bereitstellung von Informationen ist entscheidend für das reibungslose Funktionieren des Nervensystems. Bei Wirbeltieren wird es durch Myelinisierung, erleichtert, ermöglicht die Erhöhung der axonalen Wärmeleitung Geschwindigkeit1. Myelin ist eine spezielle Struktur, die durch verdichtete Schichten der Plasmamembran durch die Myelinating Glia erzeugt nämlich Oligodendrozyten in das zentrale Nervensystem (ZNS) und Schwann-Zellen im peripheren Nervensystem (PNS) gebildet. Sowohl in das ZNS und PNS, Axoglial Interaktionen fahren die Bildung von spezialisierten axonalen Domänen: die Knoten von Ranvier und ihre umliegenden Domänen, Paranodes und Juxtaparanodes2. Die axonalen Segmente isoliert von Myelin oder Internodien, wechseln sich ab mit den Knoten von Ranvier, die kleine unmyelinierten Domänen bereichert in Voltage-gated Natriumkanäle (NaV) entsprechen. Die hohe Konzentration und schnelle Aktivierung der NaV Kanäle auf den Knoten von Ranvier ermöglichen die Regeneration von Aktionspotentialen und zusammen mit den isolierenden Eigenschaften der Myelinscheiden, gewährleisten die effiziente und schnelle saltatory Wärmeleitung von der Nervenleitung längs des Axon-3.
Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Beschleunigung die Leitgeschwindigkeit der Nervenleitung unterstützt Myelinating Glia metabolische das Axon, die langfristige Integrität bewahren und die Teilnahme an den überleben-4,–5. Darüber hinaus ist deutlich in den letzten Jahren geworden, dass das Myelin dynamisch lebenslang damit vermutlich die Teilnahme bei der Regulierung und Plastizität der verschiedenen Funktionen des Nervensystems moduliert wird. Anpassungen der Verteilung, Anzahl, Länge und Dicke der Myelinscheiden entlang der Axone können somit einen neuartigen Weg, um verschiedene Netze6,7,8fein tunen darstellen. Daher die evolutionäre Übernahme von Myelin ist ein Schlüsselprozess bei sensorischen, motorischen und kognitiven Funktionen und die Störung der Interaktion zwischen Axone und Gliazellen ist zunehmend als Beitrag zu den Entwicklungsstörungen oder erworbenen neurologischen Krankheiten-9.
Myelin Zusammensetzung hat geprägt, mit der Besonderheit eines hohen Anteils von Lipiden (70 %) im Vergleich zu Proteine (30 %) im Gegensatz zu anderen zellularen Membranen10. Allerdings sind die meisten der Myelin Proteine im Gegensatz zu Myelin Lipide spezifisch für Myelin, einschließlich Myelin basic Protein (MBP), Proteolipid-Protein (PLP), 2′, 3′-cyclic Nucleotide 3′-Phosphodiesterase (CNP), Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG), Myelin-Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG), PMP-22 und P010. Verschiedenen histologische Methoden Myelin Fleck gibt es anhand seiner Lipidzusammensetzung wie Luxol schnell blau11, Sudan schwarz B12, Bakers Säure Hematin Methode13, sowie Silber Färbung14. Dennoch lassen diese Ansätze nicht immer für einen ausreichenden Kontrast und Auflösung, Einzelfasern zu visualisieren. Ein alternativer Ansatz zur Erkennung von Myelin ist durch Immunhistochemie gegen Myelin Proteine gerichtet. Verschiedene Antikörper gezielt Myelin-spezifische Antigene mit hoher Spezifität und können routinemäßig verwendet werden, um Markhaltige Strukturen zu erkennen. Die Antikörper-Antigen-Interaktion kann weiter aufgedeckt werden, dass mit einem sekundären Antikörper gekoppelt an ein Fluorophor gegen den Primärantikörper gerichtet und mit angemessenen Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Hier beschreiben wir eine immunchemische Protokoll um Myelin auf ex Vivo zerebelläre Scheiben, ein Modell zu beflecken, ermöglicht eine gute Erhaltung der Architektur des Nervengewebes. Darüber hinaus die Organisation und die Größe von den Purkinje-Zellen (die einzige Markhaltige Neuronen des Kleinhirns) machen sie ein klassisches Modell für elektrophysiologische Untersuchungen und sie sind ebenso ideal, feste oder live-Imaging-Untersuchungen durchzuführen.
Die zerebelläre Scheiben entstehen von P9 P10 Mäusen, eine Zeit entspricht dem frühen Beginn der Purkinje Zelle Myelinisierung, ein Prozess, der vor allem durch eine Woche ex Vivo (ca. 6-7 Tage in-vitro-DIV)15erreicht wird. Darüber hinaus ist dieses Modell angepasst, demyelinisierende Erkrankungen wie der multiplen Sklerose (MS), zu untersuchen, wie eine umfangreiche Demyelinisierung im Kleinhirn Scheiben mit der Myelinotoxic Verbindung Lysophosphatidylcholine (oder Lysolecithin, LPC), induziert werden kann dem folgt eine spontane Remyelinisierung16,17. Endogene Remyelinisierung findet statt von zwei Tagen nach der LPC-Entfernung aus dem Kulturmedium und ist fast eine Woche nach der Behandlung vollständig.
Die Vollendung dieses Protokolls dauert ca. 3 Wochen, einschließlich einen halben Tag lang zerebelläre Slice Kulturen Vorbereitung, eine Woche völlig Markhaltige Scheiben, gefolgt von 2 Tagen auf dem Gipfel der Demyelinisierung zu erhalten und eine weitere Woche für ihre volle Remyelinisierung. Darüber hinaus kann Immunohistochemistry in 2 Tagen abgeschlossen sein. Das hier beschriebene Protokoll ist ein standard Wurf von 6 Mäusen Welpen angepasst und hinsichtlich der Anzahl der für das geplante Experiment verwendeten Tiere angepasst werden muss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wir ausführlich ein Protokoll zum Generieren einer Ex Vivo Modell entspricht der Maus zerebelläre organotypischen Slice Kulturen adaptiert von zuvor veröffentlichten Methoden15,16,19 und das anschließende Myelin Immunostaining dieser Präparate. Diese Strategie bietet die Möglichkeit, Myelin-Komponenten mit einem hochauflösenden in gesunden und pathologischen Zuständen zu visualisieren.
Ze…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon und Dr. Thomas Roux für wertvolle Hinweise auf das Manuskript. Diese Arbeit wurde finanziert durch INSERM, ICM, ARSEP Zuschüsse R13123DD, ANR R17127DD (bis n. Chr.) und FRM Fellowship, SPF20110421435 (zu n. Chr.), FDT20170437332 (zu M.T.). Wir danken die CELIS-Zelle-Kultur-Anlage und das Icm. Quant Bildgebungsplattform.
Materials
| BME medium | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (10X HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Heat-inactivated Horse Serum | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| Penicillin–Streptomycin (10.000 IU/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-Glucose Solution (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Lysophosphatidylcholine (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Absolute ethanol (100% ethanol) | VWR Chemicals | 20821.330 | Cooled at -20°C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Normal Goat Serum (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Phosphate Buffer Solution | EuroMEDEX | ET330-A | pH 7.4 |
| Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | 06-896 | Dilution 1/300 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken) | Merck Millipore | AB9348 | Dilution 1/150 |
| Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Dilution 1/200 |
| Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma) | Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Tissue chopper | McIlwain | ||
| Razor blades | |||
| Large scissors | F.S.T | 14101-14 | |
| Small scissors | F.S.T | 91500-09 | |
| Fine-straight forceps | F.S.T | 91150-20 | |
| Curved-fine forceps | F.S.T | 11297-00 | |
| Cell culture dishes (60-mm and 100-mm) | TPP | ||
| 4-, 6-well culture plates | TPP | ||
| Millicell culture inserts (0,4 µm, 30-mm diameter) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Cell culture incubator | 37°C, 5% CO2 | ||
| Fine-end pipette tips | Dutscher | 134000CL | |
| Wide-bore pipette tips | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Sterile syringe | Terumo Europe | 20 or 50 mL | |
| Sterile syringe filters | Terumo Europe | 0.22 µm | |
| Scalpel | Swann-Morton | 0510 | |
| Brush | |||
| Microscope slides | RS France | 76 x 26 x 1.1 mm | |
| Glass coverslips | RS France | 22 x 22 mm | |
| Kimtech Sciences Tissue Wipers | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Binocular microscope |
References
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