Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi del nastro nelle specifiche regioni di frequenza della Coclea del topo

Summary

Questo manoscritto descrive un protocollo sperimentale per valutare le caratteristiche morfologiche e lo stato funzionale delle sinapsi del nastro nei topi normali. Il modello attuale è adatto anche per modelli con sinaptopatia cocleare indotta dal rumore e legati all’età. Vengono inoltre discussi i risultati correlati dei precedenti studi sul mouse.

Abstract

Le cellule ciliate interne cocleari (IHC) trasmettono segnali acustici ai neuroni gangliari a spirale (SGN) attraverso le sinapsi a nastro. Diversi studi sperimentali hanno indicato che le sinapsi delle cellule dei capelli possono essere gli obiettivi iniziali nella perdita dell’udito neurosensoriale (SNHL). Tali studi hanno proposto il concetto di cocleare “sinaptopatia”, che si riferisce ad alterazioni nel numero di sinapsi del nastro, struttura o funzione che si traducono in una trasmissione sinaptica anormale tra IHong e SGR. Mentre la sinaptopatia cocleare è irreversibile, non influisce sulla soglia uditiva. Nei modelli sperimentali indotti dal rumore, vengono impiegati danni limitati alle sinapsi IHC in determinate regioni di frequenza per identificare i fattori ambientali che causano specificamente la sinaptopatia, nonché le conseguenze fisiologiche di disturbare questo orecchio interno Circuito. Qui, presentiamo un protocollo per l’analisi della morfologia sinaptica cocleare e la funzione in una regione di frequenza specifica nei topi adulti. In questo protocollo, la localizzazione cocleare di specifiche aree di frequenza viene eseguita utilizzando mappe di frequenza dei luogo in combinazione con i dati del cocleare, a seguito del quale le caratteristiche morfologiche delle sinapsi del nastro vengono valutate tramite Immunostaining. Lo stato funzionale delle sinapsi del nastro viene quindi determinato in base alle ampiezze dell’onda I di risposta del tronco encefalico uditivo (ABR). La presente relazione dimostra che questo approccio può essere utilizzato per approfondire la nostra comprensione della patogenesi e dei meccanismi della disfunzione sinaptica nella coclea, che può aiutare nello sviluppo di nuovi interventi terapeutici.

Introduction

Le frequenze nell’intervallo di circa 20-u201220.000 Hz possono essere percepite come stimoli uditivi dagli esseri umani. L’udito umano è normalmente più sensibile vicino a 1.000 Hz, dove il livello medio di pressione sonora è di 20 – Pa nei giovani adulti (cioè, 0 decibel del livello di pressione sonora [dB SPL]). In alcune condizioni patologiche, la perdita dell’udito è limitata a frequenze specifiche. Ad esempio, nelle prime fasi della perdita dell’udito indotta dal rumore (NIHL), è possibile osservare una “notch” (cioè l’elevazione della soglia uditiva) nell’audiogramma a 4 kHz¹. Lungo la partizione cocleare dei mammiferi, le sue gradazioni di rigidità e massa producono una mappa di frequenza esponenziale, con rilevamento del suono ad alta frequenza alla base della coclea e rilevamento a bassa frequenza all’apice². Infatti, c’è una mappa posto-frequenza cocleare lungo la membrana basilare, che porta a quella che è conosciuta come organizzazione tonotopica^2,3. Ogni dato posto sulla membrana basilare ha la più alta sensibilità ad una sola particolare frequenza sonora, che di solito è chiamata la frequenza caratteristica^3,4, anche se si possono osservare anche risposte ad altre frequenze.

Fino ad oggi, sono stati impiegati vari modelli murini per studiare la normale funzione, i processi patologici e l’efficacia terapeutica nel sistema uditivo. Una conoscenza precisa dei parametri fisiologici nella coclea del topo è un prerequisito per tali studi di perdita dell’udito. La coclea del topo è anatomicamente divisa in curve apicali, medie e basali, che corrispondono a diverse regioni di frequenza. Etichettando gli afferenti del nervo uditivo presso il nucleo cocleare per analizzare i corrispondenti siti di innervazione periferica nella coclea, M’ller et al. sono riusciti a stabilire la mappa della frequenza del luogo cocleare nel normale topo⁵vivo . Nell’intervallo di 7,2–61,8 kHz, che corrisponde a posizioni comprese tra il 90% e il 10% dell’intera lunghezza della membrana basilare, la mappa della frequenza di posizionamento cocleare del topo può essere descritta da una semplice funzione di regressione lineare, suggerendo una relazione tra distanza normalizzata dalla base cocleare e dal logaritmo della frequenza caratteristica⁵. Nei topi di laboratorio, la mappa luogo-frequenza può essere utilizzata per esplorare la relazione tra soglie uditive all’interno di specifiche gamme di frequenza e cocleogrammi che mostrano il numero di cellule ciliate mancanti nelle regioni relative lungo la membrana basilare⁶. È importante sottolineare che la mappa luogo-frequenza fornisce un sistema di posizionamento per l’indagine di danni strutturali minimi, come danni alle sinapsi del nastro delle cellule ciliate in specifiche posizioni di frequenza cocleare nei topi con trauma uditivo periferico^{7 ,8}.

Nella coclea mammifera, le sinapsi del nastro sono costituite da un nastro pressinaptico, una proiezione ad alta densità di elettroni che lega un alone di vesciche sinaptiche pronte per il rilascio contenenti glutammato all’interno dell’IHC e una densità post-sinaptica sul terminale nervoso del SGN con recettori del glutammato⁹. Durante la trasduzione del suono cocleare, la deflessione del fascio di cellule ciliate provoca la depolarizzazione dell’IHC, che porta al rilascio del glutammato dagli IHC nei terminali afferenti post-rattici, attivando così il percorso uditivo. L’attivazione di questo percorso porta alla trasformazione dei segnali meccanici indotti dal suono in un codice di tasso nel SGN¹⁰. Infatti, la sinapsi a nastro IHC è altamente specializzata per la trasmissione sonora instancabile a velocità di centinaia di Hertz con alta precisione temporale, ed è di fondamentale importanza per i meccanismi pressinaptici della codifica del suono. Studi precedenti hanno rivelato che le sinapsi del nastro variano notevolmente in dimensioni e numero in diverse regioni di frequenza nella coclea del topo adulto^11,12, probabilmente riflettendo l’adattamento strutturale alla particolare codifica del suono per esigenze di sopravvivenza. Recentemente, studi sperimentali sugli animali hanno dimostrato che la sinaptopatia cocleare contribuisce a molteplici forme di ipovedenti, tra cui perdita dell’udito indotta dal rumore, perdita dell’udito legata all’età e perdita ereditaria dell’udito^{13, 14.}Pertanto, i metodi per identificare i cambiamenti correlati nel numero, nella struttura e nella funzione sinaptica in specifiche regioni di frequenza sono stati sempre più utilizzati negli studi sullo sviluppo uditivo e sulle malattie dell’orecchio interno, utilizzando modelli generati tramite manipolazione sperimentale di variabili genetiche o ambientali^15,16,17.

Nel rapporto corrente, presentiamo un protocollo per analizzare il numero sinaptico, la struttura e la funzione in una specifica regione di frequenza della membrana basilare nei topi adulti. La localizzazione della frequenza cocleare viene eseguita utilizzando una determinata mappa luogo-frequenza in combinazione con un cocleogramma. Le normali caratteristiche morfologiche delle sinapsi cocleari sono valutate tramite immunostaining presilnaptico e post-sinaptico. Lo stato funzionale delle sinapsi a nastro cocleare è determinato in base alle ampiezze soprasoglia dell’onda ABR I. Con piccole alterazioni, questo protocollo può essere utilizzato per esaminare condizioni fisiologiche o patologiche in altri modelli animali, tra cui ratti, porcellini d’India e gerbilli.

Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Guida NRC/ILAR per la cura e l’uso degli animali da laboratorio (ottava edizione). Il protocollo di studio è stato approvato dal Institutional Animal Care and Use Committee dell’Università di Medicina Capitale, Pechino, Cina. 1. Selezione degli animali Per tutti gli esperimenti, utilizzare topi maschi adulti C57BL/6J (8 settimane) come modello animale. NOT:</ I topi C57BL/6J che trasportano una variante d…

Representative Results

I test dell’udito ABR sono stati eseguiti per 10 topi C57BL/6J (8 settimane di età) in anestesia. Gli ADR sono stati suscitati utilizzando stimoli di scoppio tono a 4, 8, 16, 32 e 48 kHz. La soglia uditiva di ogni animale è stata rilevata visivamente distinguendo almeno una chiara forma d’onda nell’ABR. Tutti i topi hanno mostrato soglie ABR in risposta a raffiche di tono, che vanno da 25 a 70 dB SPL a seconda della frequenza dello stimolo. I nostri risultati hanno indicato che la soglia uditiva era più bassa a 16 kHz…

Discussion

Dal momento che la sinaptopatia cocleare è stata caratterizzata per la prima volta in topi adulti con uno spostamento di soglia temporanea (TTS) indotto da 8-u201216 kHz rumore della banda di ottava a 100 dB SPL per 2 h³¹, i ricercatori hanno sempre più studiato gli effetti della sinaptopatia in vari mammiferi, comprese le scimmie e gli esseri umani^32,33. Oltre all’esposizione al rumore, sono state associate diverse altre condizioni alla…

Materials

Ketamine hydrochloride	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China	H35020148	100mg/kg
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-1251	10mg/kg
TDT physiology apparatus	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditory Physiology System III
Electric Pad	Pet Fun	11072931136
Dumont forceps 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada	0203-3-PO
Dumont forceps 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada	0209-5-PO
Stereo dissection microscope	Nikon Corp., Tokyo, Japan	SMZ1270
Goat serum	ZSGB-BIO, Beijing,China	ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, USA	MAB397	mouse
Purified Mouse Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, USA	612044	mouse
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21124	goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21131	goat
Mounting medium containing DAPI	ZSGB-BIO, Beijing,China	ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	TCS SP8 II
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China	HS-OT10
Needle electrode	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China	1029	20 mm, 28 G
Closed-field speaker	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	CF1