Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage
Summary
Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’homogénéité étiquetage pour chaque espèce de protéine dans un échantillon complexe des protéines à l’échelle de la molécule.
Abstract
Cellule protéomes sont souvent caractérisées à l’aide de tests d’électrophorèse, où toutes les espèces de protéines dans les cellules sont non spécifiquement étiquetés avec un colorant fluorescent et sont repérés par un photodétecteur après leur séparation. Imagerie de fluorescence seule molécule peut fournir détection ultrasensible de protéines grâce à sa capacité de visualisation de molécules fluorescentes individuels. Toutefois, l’application de cette méthode d’imagerie puissante aux déterminations de l’électrophorèse est entravée par le manque de moyens pour caractériser l’homogénéité du marquage fluorescent de chaque espèce de protéines à travers le protéome. Ici, nous avons développé une méthode pour évaluer l’homogénéité d’étiquetage dans l’ensemble du protéome basé sur un test d’imagerie de fluorescence seule molécule. Dans notre mesure en utilisant un échantillon de cellules HeLa, la proportion de protéines marquées au moins un colorant, qui nous appelé « étiquetage occupation » (LO), était déterminé à gamme de 50 à 90 %, soutenant le potentiel élevé de l’application de l’imagerie de la seule molécule à analyse du protéome sensible et précis.
Introduction
Analyse du protéome, qui vise à quantifier l’ensemble des molécules de protéines exprimées dans la cellule, est une approche utile dans les études biologiques et pharmaceutiques actuelles. Cette analyse s’appuie généralement sur la spectrométrie de masse, qui identifie les espèces de protéines issus des spectres générées par l’intermédiaire de protéines ionisation1,2,3. Une autre méthode d’analyse du protéome est l’électrophorèse, y compris l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), l’électrophorèse capillaire et l’électrophorèse sur gel en deux dimensions (2D). Cette méthode repose sur le marquage fluorescent non spécifique de toutes les molécules de protéine dans les cellules analysées, suivies de la séparation par électrophorèse et de détection et de quantification de chaque espèce de protéine. Pour atteindre l’étiquetage requis des protéines non spécifiques, une stratégie consiste à utiliser des colorants fluorescents qui peuvent se lier aux protéines via des interactions électrostatiques et hydrophobes, comme le bleu de Coomassie et Sypro Ruby4,5,6 . Une autre stratégie consiste à utiliser le marquage covalent avec colorants contenant de l’ester N-hydroxysuccinimide (NHS) ou maléimide, qui peut lier par liaison covalente à des protéines par le biais de résidus communs tels que les amines primaires et thiols, respectivement7, 8.
Pendant ce temps, la sensibilité de détection de fluorescence est idéale pour l’analyse des protéines de faible abondance et un petit nombre de cellules. Imagerie de fluorescence des molécules simples est une des méthodes plus sensibles qui permet la détection des colorants fluorescents individuels et des protéines marquées in vitro et in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Application de cette méthode d’imagerie pour l’analyse protéomique axée sur l’électrophorèse est prévue pour permettre des essais hautement sensibles et quantitatives en comptant les différentes protéines fluorescent marquées. Cependant, on ne sait si l’étiquetage avec les colorants fluorescents est assez homogène dans l’ensemble de toutes les molécules de protéines, et comment cette homogénéité est affectée par des espèces de protéines différentes (Figure 1). Mesures de solution simple en vrac peuvent être utilisées pour obtenir un rapport molaire de colorants fluorescents aux protéines appelées « efficacité de couplage »8 « étiquetage efficacité », mais cette propriété ne fournit pas d’information sur l’homogénéité de l’étiquetage des molécules de protéines.
Nous décrivons ici le protocole pour un dosage d’enquêter sur l’homogénéité d’étiquetage pour toutes les espèces de protéines dans la cellule (Figure 2)16. Les deux principales étapes de ce test sont l’imagerie et purification des protéines. Dans la première étape, toutes les protéines dans les cellules sont étiquetés fluorescent et biotinylés, puis extrait séparément à l’aide de l’électrophorèse sur gel suivie par électroélution. Dans la deuxième étape, les propriétés de fluorescence des molécules de protéines individuelles dans les échantillons extraits sont évaluées basées sur l’imagerie seule molécule. Partir de ces données, paramètres importants pour l’analyse de l’inventaire, tels que le pourcentage de protéines marquées avec un moins un colorant, qui nous appelons étiquetage occupation (LO)16, et le nombre moyen de colorants fluorescents lié à une molécule de protéine unique (n̄ colorant), peuvent être caractérisés. Dans le protocole, une procédure optimisée pour l’étiquetage du protéome de cellules HeLa avec colorant de Cyanine 3 (Cy3) base d’esters NHS est présentée à titre d’exemple et peut être modifiée avec d’autres procédures d’étiquetage selon les objectifs de recherche désiré.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit un protocole afin de quantifier l’homogénéité étiquetage de chaque espèce de protéines marquées dans les cellules après la séparation avec SDS-PAGE (étape 3). La méthode de séparation peut être substituée avec d’autres méthodes comme la chromatographie en phase liquide ou électrophorèse capillaire, permettant la séparation et le fractionnement des protéines cellulaires à haute résolution, tout en nécessitant un équipement spécial23. La méthode étiq…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Masae Ohno et Kazuya Nishimura de conseils et d’assistance expérimentale. Ce travail a été soutenu par PRESTO (JPMJPR15F7), Japan Science and Technology Agency, subventions pour jeunes chercheurs (A) (24687022), contestant la recherche exploratoire (26650055) et la recherche scientifique sur les domaines innovants (23115005), la Japan Society for la Promotion de la Science et par des subventions de la Takeda Science Foundation et la fondation du mémorial Mochida à usage médical et la recherche pharmaceutique. S.L. reconnaît le soutien du programme RIKEN International programme Associate (IPA).
Materials
| 22x22x0.15 mm coverslip | VWR | 470019-004 | |
| 488 nm Argon laser | Coherent | Innova 70C | |
| 488 nm dichroic mirror | Semrock | FF495-Di03 | |
| 488 nm emission filter | Semrock | FF02-520/28 | |
| 560 nm dichroic filter | Semrock | Di02-R561 | |
| 560 nm emission filter | Semrock | FF02-617/73 | |
| 560 nm fiber laser | MBP Communications | F-04306-2 | |
| 60x oil immersion lens | Olympus | PLAPON 60x | |
| Avidin | Nacalai-tesque | 03553-64 | |
| Biotin-PEG-amine | Thermo Scientific | 21346 | |
| Biotinylated Alexa Fluor 488 | Nanocs | ||
| Borate | Nacalai-tesque | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A9547 | |
| CHAPS | Dojindo | C008-10 | |
| Cy3 NHS-ester dye | GE Healthcare | PA13101 | |
| Dialyzer – D-tube, 6-8 kDa | Merck Millipore | 71507-M | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | ||
| DTT | Nacalai-tesque | 14112-94 | |
| EDC | Nacalai-tesque | ||
| EMCCD camera | Andor | IiXon 897 | |
| Epi fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| Gel viewer | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix | Gibco | ||
| Plasma cleaner | Diener Electronic | ||
| SDS | Wako | NC0792960 | |
| Size purification column 10K | Merck Millipore | UFC5010 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
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