Første 3D celle klynge kontroll i en Hybrid Gel kube enhet for repeterbare mønster formasjoner
Summary
Vi presenterer en prosedyre for å kontrollere den første celle klynge figuren i en 3D ekstracellulær matrix å få en repeterbar mønster formasjon. En kubikk enhet som inneholder to forskjellige hydrogels er ansatt å oppnå flere retninger bildebehandling for vev mønster formasjonen.
Abstract
Betydningen av i vitro 3D kulturer er betydelig vektlagt i cellen/vev kultur. Mangel på eksperimentell repeterbarhet er imidlertid en av sine begrensninger. Noen repeterbare resultater av mønster formasjon forverres analyse av mekanismene bak selv-organisering. Redusere variasjonen i første oppdrettsforholdene, som cellen tetthet og distribusjon i den ekstracellulære matrisen (EFM), er avgjørende for å forbedre repeatability av en 3D kultur. I denne artikkelen viser vi en enkel men robust prosedyre for å kontrollere den første celle klynge figuren i en 3D ekstracellulær matrix å få svært repeterbare mønster formasjoner. En micromold med en ønsket form ble fabrikkert med klima og jordsmonn eller en maskinering prosess, og det dannet en 3D lomme i ECM i en hybrid gel kube (HGC). Høykonsentrert celler ble deretter injisert i lommen slik at celle klynge figuren fabrikkerte mold figuren. Den ansatt HGC tillatt multi-directional skanning av roteringen, som aktivert høyoppløselig bildebehandling og erobringen av hele vev strukturen selv om en lav forstørrelse objektiv ble brukt. Normal menneskelig bronkial epitelceller ble brukt til å demonstrere metodikken.
Introduction
Betydningen av en 3D kultur, som bedre etterligner biologiske miljøer enn en 2D kultur, er betydelig vektlagt i cellen/vev kultur1,2,3. Samspillet mellom cellene og ekstracellulær matrix (EFM) gir viktig signaler om morphogenesis4,5. Mange vev formasjoner kan dukke opp under 3D-miljøer, som folding prosessen6,7, invagination8og rørformede formasjon9,10. Tallrike vanskelighetene forhindrer imidlertid forskere skifter til 3D eksperimenter fra 2D eksperimenter på et fat. En av de store vanskelighetene 3D eksperimenter er spørsmålet om tenkelig 3D prøver. Sammenlignet med planar eksperimenter, er oppkjøp av aktuelle 3D-bilder fortsatt utfordrende i mange tilfeller. Spesielt er å få en passende 3D image en vanskelig oppgave når utvalgsstørrelsen når millimeter området på grunn av den store fokal dybden av lav-forstørrelse linser. For eksempel når fokal dybde mer enn 50 µm når en 10 x forstørrelse linsen brukes mens den enkelt cellen er vanligvis mindre enn 10 µm. For å forbedre bildebehandling, høyteknologiske mikroskopi systemer blir utviklet (f.eks to-fotonet mikroskopi11 og lyset arks mikroskopi systemet12), men deres tilgjengelighet er begrenset på grunn av deres dyr pris. Som et alternativ, har vi tidligere utviklet en hybrid gel kuben (HGC) enheten13. Enheten består av to typer hydrogels: agarose som en støtte gel og en ECM som kollagen eller Matrigel som en kultur gel. HGC tillater oss å samle prøven under dyrking og rotere kuben for å oppnå flere retninger bildebehandling, hvilke adresser focal dybde problemet14.
En annen vanskelighet 3D eksperimenter er deres lave repeterbarhet på grunn av det dårlige controllability av 3D-miljøer. I motsetning til en plan kultur på en plast rett oppstår variasjoner i de første oppdrettsforholdene lett i et 3D-rom omgitt av et mykt materiale. En betydelig variasjon i de eksperimentelle resultatene forverres følgende analyse og masker de underliggende mekanismene. Mange tekniske teknologier er utviklet for å justere romlig enkelt celler, for eksempel bioprinting15,16, fiber veving17, og stillas18, men de krever kompleks forbehandling eller spesielt designet utstyr. I kontrast, har vi utviklet en metode for å oppnå 3D cellejustering i en HGC19.
I denne protokollen illustrert vi en enkel prosedyre med brukte utstyr kontrollerer 3D første celle klynge formen i en HGC. Først ble fabrikasjon prosessen med HGC demonstrert. Deretter ble micromolds fabrikkert av klima og jordsmonn eller en maskinering prosess plassert i HGC å produsere en lomme med en vilkårlig figur i en ECM. Deretter ble svært tette celler etter sentrifugering injisert i lommen kontrollere første celle klynge figuren i HGC. Nøyaktig regulert celle klyngen kan avbildes fra mange retninger på grunn av HGC. Normal menneskelig bronkial (NHBE) epitelceller ble brukt til å demonstrere kontroll av den første celle klynge figuren og bildebehandling grenene fra flere retninger for forbedring av tenkelig kvaliteten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden presentert i dette papiret er enkel og kan utføres uten høyteknologisk utstyr. Samtidig, kan en presis celle klynge figur kontroll resultatet i 3D-rom av hydrogel oppnås. Etter den innledende kontrollen, kan cellene vokse i HGC som de er kultivert på et fat. Flere retninger avbilding utføres av roterende prøven med HGC med noen mikroskopi-systemet, og det betydelig forbedrer tenkelig kvaliteten. Valget av materialer for HGC ramme og micromold er fleksible så lenge de er biokompatible. En 3D-skriver kan bru…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av JSPS KAKENHI (18H 04765) og skal spre tid sporet System, MEXT, Japan.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
