التحكم الكتلة الخلية الأولى 3D في جهاز مكعب جل هجين لتشكيلات نمط التكرار
Summary
نحن نقدم إجراءات للتحكم في شكل كتلة الخلية الأولى في مصفوفة 3D خارج الخلية للحصول على تشكيل نمط تكرار. ويستخدم جهاز مكعب الذي يحتوي على اثنين من الهلاميات المائية المختلفة تحقيقا للتصوير المتعدد الاتجاهات لتشكيل نمط الأنسجة.
Abstract
إلى حد كبير هو التأكيد على أهمية الثقافات 3D في المختبر في زراعة الخلية/الأنسجة. ومع ذلك، عدم التكرار تجريبية واحدة من قيودها. نتائج قابلة للتكرار قليل من تشكيل نمط تتدهور تحليل الآليات الأساسية للتنظيم الذاتي. الحد من التفاوت في شروط الثقافة الأولية، مثل كثافة الخلية والتوزيع في المصفوفة خارج الخلية (ECM)، أمر حاسم لتعزيز التكرار ثقافة 3D. في هذه المقالة، نبدي إجراء بسيطة لكنها قوية للتحكم في شكل الكتلة الخلية الأولى في 3D مصفوفة خارج الخلية للحصول على تشكيلات نمط التكرار عالية. كانت مختلقة من ميكرومولد بشكل المطلوب باستخدام الطباعة الحجرية التصويرية أو عملية القطع، وأنها شكلت جيب 3D في المحتوى الوارد في مكعب هلام مختلطة (الوراثة). ثم تم حقن الخلايا مركزة للغاية في الجيب حيث أن الشكل الكتلة الخلية المتطابقة مع الشكل العفن ملفقة. الوراثة حسابهم يسمح متعددة الاتجاهات المسح بها التناوب، مما مكن تصوير عالي الدقة والقبض على هيكل الأنسجة كاملة حتى ولو كان يستخدم عدسة التكبير المنخفض. واستخدمت الخلايا الظهارية الشعب الهوائية الإنسان العادي لتبين المنهجية.
Introduction
إلى حد كبير هو التأكيد على أهمية ثقافة 3D، الذي يحاكي البيئات البيولوجية أفضل من لا ثقافة 2D، في خلية/الأنسجة الثقافة1،،من23. التفاعل بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) يوفر إشارات هامة بخصوص morphogenesis4،5. يمكن أن تظهر العديد من تشكيلات الأنسجة إلا في ظل بيئات ثلاثية الأبعاد، مثل عملية قابلة للطي6،7، إينفاجينيشن8، وتشكيل أنبوبي9،10. ومع ذلك، منع العديد من المصاعب الباحثين من التحول إلى تجارب 3D من تجارب 2D على طبق. واحدة من الصعوبات الرئيسية في تجارب 3D هو مسألة التصوير عينات ثلاثية الأبعاد. بالمقارنة مع تجارب مستو، الحصول على صور ثلاثية الأبعاد المناسبة لا تزال صعبة في كثير من الحالات. على وجه الخصوص، الحصول على صورة ثلاثية الأبعاد مناسبة مهمة صعبة عندما يصل حجم العينة مجموعة ملليمتر نظراً لعمق تركيز كبير من عدسات التكبير المنخفض. على سبيل المثال، يصل عمق التنسيق إلى أكثر من 50 ميكرومتر عندما يستخدم من 10 x عدسة التكبير بينما حجم الخلية واحد هو عادة أقل من 10 ميكرون. لتحسين نوعية التصوير، يجري تطوير نظم الفحص المجهري التكنولوجيا العالية (مثلاً، مجهرية اثنين-فوتون11 و نظام الفحص المجهري الضوء-ورقة12)، ولكن محدودة بسبب أسعارها غالية الإتاحة الخاصة بهم. وكبديل لذلك، قد سبق أن وضعت مختلطة هلام مكعب (الوراثة) جهاز13. الجهاز يتكون من نوعين من الهلاميات المائية: [اغروس] هلام دعم وإدارة المحتوى في المؤسسة مثل الكولاجين أو ماتريجيل كهلام ثقافة. الوراثة يسمح لنا بجمع العينة خلال استزراع وتدوير المكعب لتحقيق تصوير متعددة الاتجاهات، الذي يعالج مشكلة العمق البؤري14.
وهناك صعوبة أخرى في تجارب 3D هو على التكرار المنخفض نظراً لقابلية التحكم الفقراء من بيئات 3D. خلافا لثقافة المستوية في طبق بلاستيك، تحدث الاختلافات في الظروف الأولية الثقافة بسهولة في الفضاء 3D محاطة بمادة ناعمة. تباين كبير في النتائج التجريبية تتدهور التحليل التالي وأقنعة الآليات الكامنة. وقد وضعت العديد من التقنيات الهندسية مكانياً محاذاة الخلايا المفردة، مثل بيوبرينتينج،من1516، ألياف النسيج17و18من السقالات، ولكنها تتطلب تجهيزها معقدة أو على وجه التحديد معدات مصممة. وفي المقابل، قمنا بتطوير منهجية لتحقيق المحاذاة لخلية ثلاثية الأبعاد في الوراثة19.
في هذا البروتوكول، يتضح أننا إجراء بسيط مع المعدات المستخدمة عادة للتحكم في الشكل الكتلة الخلية الأولى ثلاثية الأبعاد في الوراثة. أولاً، قد أظهرت عملية التصنيع الوراثة. ثم وضعت ميكرومولدس ملفقة بالطباعة الحجرية التصويرية أو عملية القطع في الوراثة لإنتاج جيب بشكل تعسفي في إدارة المحتوى في المؤسسة. لاحقاً، تم حقن الخلايا عالية الكثافة بعد الطرد المركزي في الجيب للتحكم في شكل الكتلة الخلية الأولى في الوراثة. يمكن تصويرها الكتلة الخلية التي تسيطر عليها تحديداً من اتجاهات عديدة بسبب الوراثة. واستخدمت العادي البشرية الشعب الهوائية (نهبي) الخلايا الظهارية لإثبات السيطرة على شكل كتلة الخلية الأولى والتصوير من الفروع من اتجاهات متعددة لتعزيز نوعية التصوير.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة المعروضة في هذه الورقة هو بسيط ويمكن أن يؤديها دون معدات التكنولوجيا العالية. وفي الوقت نفسه، يمكن الحصول على نتيجة عنصر تحكم شكل كتلة خلية دقيقة في الفضاء ثلاثي الأبعاد للمائية. بعد مراقبة أولية، يمكن أن تنمو الخلايا في الوراثة قدر ما هم مثقف على طبق. يتم إجراء تصوير متعددة الاتجا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها ماليا JSPS كاكينهي (ح 18 04765) وبرنامج لنشر نظام المسار الحيازة، يأمرون، واليابان.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
