화학 유인 그라데이션에 대 한 다중 세포 반응의 3D 분석
Summary
우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.
Abstract
2D 세포 배양 시스템의 다양 한 한계는 살아있는 조직의 공간적 및 화학적 복잡성을 더 잘 모방 하 고 생체 내 조직 기능을 모방 하는 3D 세포 배양 및 분석 플랫폼에 대 한 관심을 촉발 시켰습니다. 최근 미세 제조 기술의 진보는 세포가 잘 정의 된 세포 외 기질 (ECM)과 가용성 또는 매트릭스 관련 생체 분자의 정의 된 집합으로 통합 될 수 있는 생체 외 환경에서의 개발을 촉진 시켰다. 그러나, 기술 장벽은 연구 실험실에서 그들의 대폭적인 사용을 제한 했습니다. 여기서, 우리는 정의 된 화학 유인 구배와 함께 3D 미세 환경에서 세포와 멀티 셀로 노이 드와 3D 문화와 실험을 위한 간단한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 플랫폼의 사용은 상피 세포와 유기 체의 반응의 분석을 위해 표 피 성장 인자 (EGF)와 같은 성장 인자의 그라데이션에 관한 것 이다. EGF 그라데이션은 유 방 소기관에서 지시 된 지점 형성으로 이어지는 며칠 동안 장치에서 안정 하였다. 이 분석을 통해 셀 그룹에의 한 집단 그라데이션 감지가 더 민감하고 단일 셀 이라고 결론을 내릴 수 있었습니다. 우리는 또한 포토 리소 그래피 시설이 나 고급 소프트 리소 그래피 기술이 필요 하지 않은 제조 방법을 설명 합니다. 이 방법은 암을 포함 하 여 발달 및 병리학 적 상태 분석의 맥락에서 3D 세포 거동을 연구 하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
생리 적 환경에서 세포는 셀 외 기질 (ECM)에 내장 되어 과다 한 생체 분자에 노출 됩니다. 세포와 주변 미세 환경 사이의 상호 작용은 마이그레이션, 성장, 분화 및 생존1을포함 하 여 다양 한 표현 형을 제어 하는 세포내 프로세스를 조절 합니다. 많은 것은 종래의 2D 세포 배양에서 세포 거동에 대해 배웠다. 그러나 3D 하이드로 겔에 내장 된 세포에 대 한 생체 내 이미징 및 실험의 출현으로, 세포 거동에 중요 한 차이는 간단한 2D 시험관 내 배양과 3D 조직 유사 환경에서 인식 되었습니다. 셀이 ECM 섬유와 상호 작용 하 고 3D 매트릭스 내에서 기계적 특성을 감지 하는 동안 젤의 재료 강성은 2D 시험관 시스템에서 완전히 독립 된 변수가 아닙니다. 차원은 초점 부착 형성을 변경 하 여 다른 세포 형태학과 행동을 초래 합니다. 또한 2D 표면의 셀은 3D에서 모든 방향으로 열린 셀 보다 더 적은 신호 전달에 노출 됩니다.
이러한 한계는 생체 조직의 공간적 및 화학적 복잡성을 나타내고 체 내 조직 기능을 더 잘 예측 하는 3D 시스템에 대 한 관심을 증가 시켰습니다. 그들은 ECM3,4에 무작위로 산재 된 세포에 세포 마이크로 구조체를 자체 조립 하는 것과 같은 다양 한 형태로 개발 되었습니다. 미세 제조 기술의 최근 진보는 표현 형 변화를 연구 하기 위한 3d 배양 시스템 (5,6,7,8,9 )의 출현을 촉진 하 고 가용성 신호에 대 한 세포 반응; 그러나, 기술 장벽은 연구 실험실에서 널리 사용을 제한 합니다. 대부분의 경우 제작 공정에는 포토 리소 그래피 기법과 배경 지식을이 필요 합니다. 더욱이, 장치를 성공적으로 구축 하 고 장기간에 걸쳐 장치의 최적 기능을 달성 하기 위해 다양 한 요인을 제어 해야 합니다.
우리의 방법은 정의 된 화학 유인 구배와 함께 3 차원 미세 환경에 세포 및 멀티 세포 소기관을 통합 하 고 EGF10에 대 한 상피 반응을 분석 하기 위한 3d PDMS 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 당사의 데이터에의 하면, 얕은 EGF 그라데이션에 반응 하는 소기관의 용량은 갭 접합부를 통한 세포 간 화학적 커플링에서 발생 합니다. 이는 취약 하 고 시끄러운 공간적으로 등급이 매겨진 입력을 보다 정밀 하 게 감지할 수 있는 소기관의 가능성을 시사 합니다. 제조 공정은 청정 실 시설이 나 포토 리소 그래피 기술이 필요 하지 않습니다. 그러나, 3D PDMS 디바이스는 3D 생리학적 환경의 필요한 요인을 포함 한다. 이 방법은 3D 셀룰러 동작을 연구 하는 데 도움이 될 것 이며 다른 세포 유형, chemoattractants 및 ECM 조합으로 큰 연구 잠재력이 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS 몰드의 제작은 상업용 3D 프린팅 서비스를 사용 하 여 수행 되었지만, 사내 하이 엔드 3D 프린터로도 수행할 수 있습니다. 다양 한 3D 제작 방법 중에서 입체 리소 그래피는 고해상도 몰드 생성에 권장 됩니다. PDMS 경화는 고온 (80 ° c)에서 발생 하기 때문에 인쇄를 아웃소싱 할 경우 재료는 충분히 열적으로 내성이 있어야 하며이를 명시적으로 지정 해야 합니다. 열 후 경화는 부품의 열 저항을 높…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 AJE (NSF PD-11-7246, 유방암 연구 재단 (BCRF-17-048) 및 NCI U54 CA210173) 및 AL (U54CA209992)에 대 한 보조금에 의해 지원 되었다.
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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