3D-analys av flera cellulära svar på Chemoattractant gradienter
Summary
Vi beskriver en metod för att konstruera enheter för 3D-kultur och experiment med celler och flercelliga organoider. Denna enhet möjliggör analys av cellulära svar på lösliga signaler i 3D mikromiljöer med definierade korrektiv gradienter. Organoider är bättre än enstaka celler vid detektering av svaga bullriga ingångar.
Abstract
Olika begränsningar av 2D cell kultur system har väckt intresse för 3D cell kultur och analysplattformar, som bättre skulle efterlikna den rumsliga och kemiska komplexiteten i levande vävnader och efterlikna in vivo vävnads funktioner. Den senaste tidens framsteg inom mikrofabrikation teknik har underlättat utvecklingen av 3D in vitro-miljöer där celler kan integreras i en väldefinierad extracellulär matris (ECM) och en definierad uppsättning lösliga eller matris associerade bio molekyler. Tekniska hinder har dock begränsat deras utbredda användning i forsknings laboratorier. Här beskriver vi en metod för att konstruera enkla enheter för 3D-kultur och experiment med celler och flercelliga organoider i 3D mikromiljöer med en definierad korrektiv lutning. Vi illustrerar användningen av denna plattform för analys av responsen från epitelceller och organoider till lutningar av tillväxtfaktorer, såsom Epidermal tillväxtfaktor (EGF). EGF lutningar var stabila i enheterna under flera dagar vilket ledde till riktad gren bildning i bröstorganoider. Denna analys tillät oss att dra satsen att kollektiv gradient avkänning av grupper av celler är känsligare kontra enstaka celler. Vi beskriver också tillverknings metoden, som inte kräver fotolitografianläggningar eller avancerade mjuka litografitekniker. Denna metod kommer att vara till hjälp för att studera 3D cellulära beteenden i samband med analys av utveckling och sjukdoms tillstånd, inklusive cancer.
Introduction
I fysiologisk miljö är cellerna inbäddade i en extracellulär matris (ECM) och exponeras för en uppsjö av bio molekyler. Interaktioner mellan celler och den omgivande mikromiljön reglerar intracellulära processer som styr olika fenotyper, inklusive migration, tillväxt, differentiering och överlevnad1,2. Mycket har lärt sig om cellulära beteenden i en konventionell 2D cell kultur. Men med tillkomsten av intravital avbildning och experimenterande med celler inbäddade i 3D hydrogels, viktiga skillnader i cell beteenden har erkänts i den förenklade 2D in vitro-kulturer kontra 3D vävnad-liknande miljöer. Medan cellerna interagerar med ECM-fibrer och känner deras mekaniska egenskaper inom 3D-matrisen, är den materiella styvheten hos gelen inte en helt oberoende variabel i ett 2D in vitro-system. Dimensionaliteten förändrar fokala vidhäftnings bildning, vilket resulterar i olika Cellmorfologi och beteende. Dessutom utsätts celler på en 2D-yta för färre signal signaler än celler som är öppna för alla riktningar i 3D.
Dessa begränsningar har ökat intresset för 3D-system som representerar den rumsliga och kemiska komplexiteten i levande vävnader och bättre förutsäga in vivo vävnads funktioner. De har utvecklats i många former från organoider som själv montering cellulära mikrostrukturer till celler slumpmässigt varvat i ECM3,4. De senaste framstegen inom mikrofabrikation Technologies har underlättat tillkomsten av olika typer av 3D kultur system5,6,7,8,9 för att studera fenotypiska förändringar och cellulära svar på lösliga signaler; tekniska hinder begränsar dock den utbredda användningen i forsknings laboratorier. I många fall kräver tillverknings processerna foto litografi tekniker och bakgrunds kunskaper för mjuk litografi. Dessutom måste olika faktorer kontrol leras för att framgångs rikt bygga en enhet och för att uppnå en optimal funktion av enheten under en lång tid.
Vår metod beskriver hur man konstruerar en 3D PDMS-enhet för att införliva celler och multicellulära organoider i en 3D-mikromiljö med definierade kemoattractant lutningar och sedan analysera epiteliala svar på EGF10. Våra data avslöjar att kapaciteten hos organoider att reagera på grunda EGF-gradienter uppstår från intercellulära kemiska kopplingar genom gap korsningar. Det antyder potentialen av organoider för mer exakt detektering av svaga och bullriga rumsligt graderade ingångar. Tillverknings processen kräver inte en renrum anläggning eller Photolithography tekniker. 3D PDMS-enheten innehåller dock nödvändiga faktorer för 3D-fysiologisk miljö. Denna metod kommer att vara till hjälp för att studera 3D cellulära beteenden och det har stor forskningspotential med olika cell typer, kemoattractants, och ECM kombinationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillverkningen av PDMS formar utfördes med hjälp av en kommersiell 3D-utskrift tjänst, men kan också åstadkommas genom en hög 3D-skrivare i huset. Bland olika 3D-metoder för tillverkning, Stereolitografi rekommenderas för hög upplösning mögel generation. Eftersom PDMS härdning sker vid en hög temperatur (80 ° c), bör materialen vara tillräckligt termiskt resistenta, vilket bör specificeras explicit, om utskriften är outsourcad. En termisk post-Cure kan diskuteras med tryckeriet företag för att öka de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag till AJE (NSF PD-11-7246, bröst Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), och NCI U54 CA210173) och AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
