Analyse 3D des réponses multi-cellulaires aux gradients chemoattractant
Summary
Nous décrivons une méthode pour construire des dispositifs pour la culture 3D et l’expérimentation avec des cellules et des organoïdes multicellulaires. Ce dispositif permet l’analyse des réponses cellulaires aux signaux solubles dans les microenvironnements 3D avec des gradients chimioattractant définis. Les organoïdes sont meilleurs que les cellules simples à la détection des faibles entrées bruyantes.
Abstract
Diverses limitations des systèmes de culture cellulaire 2D ont suscité l’intérêt pour la culture cellulaire 3D et les plateformes d’analyse, qui imiteraient mieux la complexité spatiale et chimique des tissus vivants et imitent les fonctions tissulaires in vivo. Les progrès récents dans les technologies de microfabrication ont facilité le développement d’environnements in vitro en 3D dans lesquels les cellules peuvent être intégrées dans une matrice extracellulaire bien définie (ECM) et un ensemble défini de biomolécules solubles ou matricielles associées. Cependant, les barrières technologiques ont limité leur utilisation généralisée dans les laboratoires de recherche. Ici, nous décrivons une méthode pour construire des dispositifs simples pour la culture 3D et l’expérimentation avec des cellules et des organoïdes multicellulaires dans des microenvironnements 3D avec un gradient chimioattractant défini. Nous illustrons l’utilisation de cette plate-forme pour l’analyse de la réponse des cellules épithéliales et des organoïdes aux gradients de facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance épidermique (EGF). Les gradients du FEM étaient stables dans les dispositifs pendant plusieurs jours conduisant à la formation dirigée des branches dans les organoïdes du sein. Cette analyse nous a permis de conclure que la détection de gradient collectif par groupes de cellules est plus sensible par rapport aux cellules individuelles. Nous décrivons également la méthode de fabrication, qui ne nécessite pas d’installations de photolithographie ni de techniques de lithographies douces avancées. Cette méthode sera utile pour étudier les comportements cellulaires 3D dans le contexte de l’analyse du développement et des états pathologiques, y compris le cancer.
Introduction
Dans l’environnement physiologique, les cellules sont incorporées dans une matrice extracellulaire (ECM) et exposées à une pléthore de biomolécules. Les interactions entre les cellules et le microenvironnement environnant régulent les processus intracellulaires contrôlant divers phénotypes, y compris la migration, la croissance, la différenciation et la survie1,2. Beaucoup a été appris sur les comportements cellulaires dans une culture de cellules 2D conventionnelles. Cependant, avec l’avènement de l’imagerie intravitale et l’expérimentation de cellules incorporées dans des hydrogels 3D, des différences importantes dans les comportements cellulaires ont été reconnues dans les cultures 2D in vitro simplifiées par rapport aux environnements de tissus 3D. Alors que les cellules interagissent avec les fibres ECM et sentent leurs propriétés mécaniques dans la matrice 3D, la rigidité matérielle du gel n’est pas une variable totalement indépendante dans un système in vitro 2D. La dimensionnalité modifie la formation d’adhérence focale, ce qui entraîne une morphologie et un comportement différents des cellules. En outre, les cellules sur une surface 2D sont exposées à moins de signaux de signalisation que les cellules ouvertes à toutes les directions en 3D.
Ces limitations ont accru les intérêts pour les systèmes 3D qui représentent la complexité spatiale et chimique des tissus vivants et mieux prédire les fonctions tissulaires in vivo. Ils ont été développés sous de nombreuses formes à partir d’organoïdes comme microstructures cellulaires auto-assemblées à des cellules aléatoirement intercalées dans ECM3,4. Les progrès récents dans les technologies de microfabrication ont facilité l’avènement de différents types de systèmes de culture 3D5,6,7,8,9 pour l’étude des changements phénotypiques et réponses cellulaires aux signaux solubles; Cependant, les barrières technologiques limitent l’utilisation généralisée dans les laboratoires de recherche. Dans de nombreux cas, les procédés de fabrication exigent des techniques de photolithographie et des connaissances de fond pour la lithographie douce. En outre, divers facteurs doivent être contrôlés pour construire avec succès un dispositif et pour obtenir une fonction optimale de l’appareil sur une longue période de temps.
Notre méthode décrit comment construire un dispositif 3D de RPDB pour incorporer des cellules et des organoïdes multicellulaires dans un microenvironnement 3D avec des gradients chimioattractant définis, puis analyser les réponses épithéliales au FEM10. Nos données révèlent que la capacité des organoïdes à réagir aux gradients de l’EGF peu profonds découle du couplage chimique intercellulaire par des jonctions d’interstices. Il suggère le potentiel des organoïdes pour la détection plus précise des intrants faibles et bruyants spatialement classés. Le processus de fabrication ne nécessite pas d’installation de salle blanche ni de techniques de photolithographie. Cependant, le dispositif 3D de la PDA comprend les facteurs nécessaires de l’environnement physiologique 3D. Cette méthode sera utile pour étudier les comportements cellulaires 3D et il a un grand potentiel de recherche avec différents types de cellules, chimioattractants, et les combinaisons ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fabrication de moules de PDA a été réalisée à l’aide d’un service commercial d’impression 3D, mais peut également être réalisée par une imprimante 3D haut de gamme en interne. Parmi les différentes méthodes de fabrication 3D, la stéréolithographie est recommandée pour la génération de moules haute résolution. Étant donné que la polymérisation du RPDB se produit à une température élevée (80 ° c), les matériaux doivent être suffisamment résistants thermiquement, ce qui devrait être exp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par des subventions à l’AJE (NSF DP-11-7246, Fondation de recherche sur le cancer du sein (BCRF-17-048), et NCI U54 CA210173) et AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
