化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析
Summary
我々は、細胞および多細胞オルガノイドを用いて3D 培養および実験のためのデバイスを構築する方法について述べる。この装置は定義された化学誘引物質の勾配の3D 微小環境の可溶性信号への細胞応答の分析を可能にする。オルガノイドは、弱いノイズの入力の検出で単一のセルよりも優れています。
Abstract
2D 細胞培養システムの様々な制限は、3D 細胞培養および分析プラットフォームに対する関心を呼び起こし、生体組織の空間的および化学的複雑性を模倣し、インビボ組織機能を模倣する。微細加工技術の最近の進歩は、細胞が十分に定義された細胞外マトリックス (ECM) および可溶性またはマトリックス関連の生体分子の定義されたセットに統合することができるインビトロ環境における3D の開発を促進した。しかし、技術の壁は、研究室での普及を制限している。ここでは、化学誘引物質勾配を定義した3D 微小環境において、細胞や多細胞オルガノイドを用いて3D 培養や実験のための簡単な装置を構築する方法について述べる。我々は、上皮細胞の応答の分析のためのこのプラットフォームの使用を説明し、上皮増殖因子 (EGF) などの成長因子の勾配にオルガノイドします。EGF の勾配は、乳房オルガノイドにおける分岐形成を誘導する数日間の装置において安定であった。この分析により、セルのグループによる集合的な勾配検出は、単一のセルよりも敏感であると結論づけることができました。また、リソグラフィー設備や高度なソフトリソグラフィ技術を必要としない製造方法についても述べる。この方法は、癌を含む開発と病理学的状態の分析の文脈で3D 細胞の挙動を研究するのに役立ちます。
Introduction
生理的環境においては、細胞はセル外マトリックス (ECM) に埋め込まれ、大量の生体分子に曝露される。細胞と周囲の微小環境との相互作用は、遊走、成長、分化および生存を含む多様な表現型を制御する細胞内プロセスを調節する1,2.従来の2D 細胞培養において細胞の挙動について多くのことが学ばれてきた。しかしながら、3D ヒドロゲルに埋め込まれた細胞を用いた生体画像化および実験の出現により、細胞挙動における重要な相違は、3D 組織様環境と比較して単純化された 2D in vitro 培養で認められるようになった。細胞は ECM 繊維と相互作用し、3D マトリックス内でその機械的特性を感知しますが、ゲルの材料剛性は、2D in vitro システムでは完全に独立した変数ではありません。次元は焦点の付着の形成を変え、異なった細胞形態および行動をもたらす。さらに、2D サーフェス上のセルは、3D のすべての方向に開いているセルよりも少ないシグナリングキューにさらされます。
これらの制限は、生体組織の空間的および化学的複雑性を表す3D システムの関心を高め、インビボ組織機能をよりよく予測する。彼らは、ECM3,4にランダムに散在する細胞への自己組織化細胞微細構造として、オルガノイドから多くの形で開発されています。微細加工技術の最近の進歩は、表現型の変化を研究するための様々なタイプの3d 培養システム5、6、7、8、9の出現を促進し、可溶性信号への細胞応答;しかし、技術的な障壁は、研究室での普及を制限します。多くの場合、製造プロセスは、軟リソグラフィのためのフォトリソグラフィー技術と背景知識を必要とします。さらに、デバイスを正常に構築し、デバイスの最適な機能を長期間にわたって実現するには、さまざまな要因を制御する必要があります。
我々の方法は、定義された化学誘引物質勾配を有する3D 微小環境に細胞および多細胞オルガノイドを組み込み、その後、EGF10に対する上皮応答を分析するための 3d PDMS 装置を構築する方法を記述する。我々のデータは、浅い EGF 勾配に応答するオルガノイドの能力が、ギャップ結合を介した細胞間化学的カップリングから生じることを明らかにしている。それは弱く、騒々しい空間的に等級付けられた入力のより精密な検出のためのオルガノイドの潜在性を示す。製造工程はクリーンルーム設備やフォトリソグラフィー技術を必要としません。しかし、3D PDMS デバイスには、3D 生理学的環境の必要な要素が含まれています。この方法は、3D 細胞の挙動を研究するのに役立ち、異なる細胞タイプ、chemoattractants、および ECM の組み合わせによる優れた研究の可能性を秘めています。
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS 金型の製作は、市販の3D プリンティングサービスを使用して行われましたが、自社内のハイエンド3D プリンタでも実現できます。様々な3D 加工方法の中で、高解像度のモールド生成には立体造形が推奨されます。PDMS 硬化は、高温 (80 ° c) で発生するため、材料は、印刷が外部委託されている場合は、明示的に指定する必要があり、十分に熱耐性でなければなりません。サーマルポストキ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、AJE (NSF PD-11-7246、乳癌研究財団 (BCRF-17-048)、および NCI U54 CA210173) および AL (U54CA209992) への補助金によって支持された。
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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