Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant
Summary
Describimos un método para construir dispositivos para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares. Este dispositivo permite el análisis de las respuestas celulares a señales solubles en microambientes 3D con degradados de quimioattractant definidos. Los organoides son mejores que las células individuales en la detección de entradas ruidosas débiles.
Abstract
Varias limitaciones de los sistemas de cultivo celular 2D han despertado interés en las plataformas de análisis y cultivo celular 3D, que imitaría mejor la complejidad espacial y química de los tejidos vivos y imitará las funciones de tejido in vivo. Los recientes avances en las tecnologías de microfabricación han facilitado el desarrollo de entornos 3D in vitro en los que las células pueden integrarse en una matriz extracelular bien definida (ECM) y un conjunto definido de biomoléculas solubles o asociadas a matrices. Sin embargo, las barreras tecnológicas han limitado su uso generalizado en los laboratorios de investigación. Aquí describimos un método para construir dispositivos simples para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares en microentornos 3D con un gradiente de quimioattractant definido. Ilustramos el uso de esta plataforma para el análisis de la respuesta de células epiteliales y organoides a gradientes de factores de crecimiento, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF). Los gradientes de EGF fueron estables en los dispositivos durante varios días, lo que condujo a la formación de ramas dirigidas en organoides mamarios. Este análisis nos permitió concluir que la detección de gradiente colectiva por grupos de células es más sensible frente a células individuales. También describimos el método de fabricación, que no requiere instalaciones de fotolitografía ni técnicas avanzadas de litografía blanda. Este método será útil para estudiar los comportamientos celulares en 3D en el contexto del análisis del desarrollo y los estados patológicos, incluyendo el cáncer.
Introduction
En el entorno fisiológico, las células se incrustan en una matriz extracelular (ECM) y se exponen a una plétora de biomoléculas. Las interacciones entre las células y el microentorno circundante regulan los procesos intracelulares que controlan diversos fenotipos, incluyendo la migración, el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia1,2. Se ha aprendido mucho acerca de los comportamientos celulares en un cultivo celular 2D convencional. Sin embargo, con el advenimiento de la imagen intravital y la experimentación con células incrustadas en los hidrogeles 3D, se han reconocido importantes diferencias en los comportamientos celulares en los cultivos 2D in vitro simplificados frente a los entornos de tejido 3D. Mientras que las células interactúan con las fibras de ECM y detectan sus propiedades mecánicas dentro de la matriz 3D, la rigidez del material del gel no es una variable totalmente independiente en un sistema 2D in vitro. La dimensionalidad altera la formación de adherencia focal, resultando en diferentes morfología y comportamiento de las células. Además, las celdas en una superficie 2D se exponen a menos señales de señalización que las celdas abiertas a todas las direcciones en 3D.
Estas limitaciones han incrementado los intereses de los sistemas 3D que representan la complejidad espacial y química de los tejidos vivos y predicen mejor las funciones de tejido in vivo. Se han desarrollado en muchas formas a partir de organoides como microestructuras celulares de auto-ensamblaje a las células intercaladas aleatoriamente en ECM3,4. Los recientes avances en las tecnologías de microfabricación han facilitado el advenimiento de varios tipos de sistemas de cultivo 3D5,6,7,8,9 para estudiar los cambios fenotíricos y respuestas celulares a señales solubles; sin embargo, las barreras tecnológicas limitan el uso generalizado en los laboratorios de investigación. En muchos casos, los procesos de fabricación requieren técnicas de fotolitografía y conocimientos de fondo para la litografía blanda. Por otra parte, varios factores deben ser controlados para construir con éxito un dispositivo y para lograr una función óptima del dispositivo durante un largo período de tiempo.
Nuestro método describe cómo construir un dispositivo PDMS 3D para incorporar células y organoides multicelulares en un microentorno 3D con gradientes de prenilado definidos y luego analizar las respuestas epiteliales al EGF10. Nuestros datos revelan que la capacidad de los organoides para responder a los degradados de EGF superficiales surge del acoplamiento químico intercelular a través de uniones de brecha. Sugiere el potencial de los organoides para una detección más precisa de entradas débiles y ruidosas espacialmente graduadas. El proceso de fabricación no requiere una instalación de sala limpia ni técnicas de fotolitografía. Sin embargo, el dispositivo PDMS 3D incluye los factores necesarios del entorno fisiológico 3D. Este método será útil para estudiar comportamientos celulares en 3D y tiene un gran potencial de investigación con diferentes tipos de células, quimioattractantes, y combinaciones de ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fabricación de moldes PDMS se realizó utilizando un servicio de impresión 3D comercial, pero también puede ser logrado por una impresora 3D de alta gama en la casa. Entre los diversos métodos de fabricación 3D, la estereolitografía se recomienda para la generación de moldes de alta resolución. Debido a que el curado PDMS se produce a una temperatura alta (80 ° c), los materiales deben ser suficientemente resistentes térmicamente, lo que debe especificarse explícitamente, si la impresión es externalizada. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por donaciones a AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), y NCI U54 CA210173) y AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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