Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو وصف نهج لتحليل سلوك الخلايا الجذعية العصبية الكبار / الخلايا السلف ردا على التلاعب الكيميائي من دائرة عصبية محلية محددة.
Abstract
تكوين الأعصاب لدى البالغين هو عملية ديناميكية تقوم من خلالها الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) التي تم تنشيطها حديثًا في المنطقة تحت الحبيبية (SGZ) من الجبس الدنتات (DG) بإنشاء خلايا عصبية جديدة، والتي تندمج في دائرة عصبية موجودة وتساهم في وظائف فرس النهر المحددة . الأهم من ذلك، تكوين الأعصاب الكبار هو عرضة للغاية للمحفزات البيئية، والذي يسمح لتنظيم تعتمد على النشاط من مختلف الوظائف المعرفية. مجموعة واسعة من الدوائر العصبية من مناطق الدماغ المختلفة ينظم هذه الوظائف المعرفية المعقدة. ولذلك من المهم أن نفهم كيف تنظم الدوائر العصبية المحددة تكوين الأعصاب للبالغين. هنا، ونحن نصف بروتوكول للتعامل مع نشاط الدائرة العصبية باستخدام مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل مصمم الأدوية (DREADDs) التكنولوجيا التي تنظم NSCs وذرية حديثي الولادة في القوارض. ويشمل هذا البروتوكول الشامل حقن الجسيمات الفيروسية المجسمة، والتحفيز الكيميائي للدوائر العصبية المحددة، والإدارة التناظرية الثيميدين، ومعالجة الأنسجة، ووضع العلامات المناعية، والتصوير البؤري، والتصوير تحليل مراحل مختلفة من الخلايا العصبية السلائف. يوفر هذا البروتوكول تعليمات مفصلة حول تقنيات استرجاع المستضد المستخدمة لتصور NSCs وذريتها ويصف طريقة بسيطة، ولكنها فعالة لتعديل دوائر الدماغ باستخدام كلوزابين N-أكسيد (CNO) أو CNO التي تحتوي على مياه الشرب و الفيروسات التي تعبر عن الفزع. تكمن قوة هذا البروتوكول في قدرته على التكيف لدراسة مجموعة متنوعة من الدوائر العصبية التي تؤثر على تكوين الأعصاب للبالغين المستمدة من NSCs.
Introduction
تكوين الأعصاب للبالغين هو عملية بيولوجية يتم من خلالها ولادة الخلايا العصبية الجديدة في شخص بالغ ودمجها في الشبكات العصبية القائمة1. في البشر ، تحدث هذه العملية في سايروس dentate (DG) من الحصين ، حيث يولد حوالي 1400 خلية جديدة كل يوم2. هذه الخلايا موجودة في الجزء الداخلي من المديرية العامة، التي تأوي محراب عصبي، يسمى المنطقة تحت الحبيبية (SGZ). هنا، تخضع الخلايا الجذعية العصبية البالغة (NSCs) لعملية تنموية معقدة لتصبح خلايا عصبية تعمل بكامل طاقتها تساهم في تنظيم وظائف الدماغ المحددة، بما في ذلك التعلم والذاكرة، وتنظيم المزاج، واستجابة الإجهاد3 ،4،5،6. للتأثير على السلوكيات، يتم تنظيم NSCs الكبار بشكل كبير من قبل مختلف المحفزات الخارجية بطريقة تعتمد على النشاط من خلال الاستجابة لمجموعة من الإشارات الكيميائية المحلية والبعيدة. وتشمل هذه العظة الكيميائية الناقلات العصبية وneuromodulators والعمل بطريقة محددة دائرة من مختلف مناطق الدماغ. والأهم من ذلك، أن التقارب الواسع بين هذه الدوائر الكيميائية على النقاط القومية الوطنية يسمح بتنظيم فريد ودقيق لتفعيل الخلايا الجذعية، والتمايز، وقرارات المصير.
واحدة من أكثر الطرق فعالية لاستجواب تنظيم الدائرة من NSCs الكبار في الجسم الحي هو عن طريق الجمع بين تحليل الفلورة المناعية مع التلاعب الدائرة واسعة. تحليل الفلورة المناعية للبالغين NSCs هو تقنية تستخدم عادة، حيث يتم استخدام الأجسام المضادة ضد علامات جزيئية محددة للإشارة إلى مرحلة النمو من NSCs الكبار. وتشمل هذه العلامات: العشين كخلية غليا شعاعي وعلامة الذرية العصبية في وقت مبكر، Tbr2 كعلامة السلف المتوسطة، وdcx كneuroblast وعلامة الخلايا العصبية غير ناضجة7. بالإضافة إلى ذلك، من خلال إدارة نظائر الثيميدين مثل BrdU، سيدو، إدو، وإدو، يمكن تسمية السكان الخلية التي تمر مرحلة S بشكل فردي وتصور8،9،10. ومن خلال الجمع بين هذين النهجين، يمكن التحقيق في مجموعة واسعة من الأسئلة تتراوح بين كيفية تنظيم الانتشار في مراحل تنموية محددة، وكيفية تأثير العظة المختلفة على تمايز مجلس الأمن القومي وتكوين الأعصاب.
توجد عدة خيارات للتعامل بفعالية مع الدوائر العصبية بما في ذلك التحفيز الكهربائي، علم الوراثة البصرية، وعلم الوراثة الكيميائية، ولكل منها مزاياها وعيوبها الخاصة. التحفيز الكهربائي ينطوي على عملية جراحية واسعة النطاق حيث يتم زرع الأقطاب الكهربائية إلى منطقة الدماغ المحددة التي تستخدم في وقت لاحق لنقل الإشارات الكهربائية لتعديل منطقة الدماغ المستهدفة. ومع ذلك، يفتقر هذا النهج إلى خصوصية الدوائر الخلوية والدوائر على حد سواء. علم الوراثة البصرية ينطوي على تسليم الجسيمات الفيروسية التي ترميز مستقبلات تنشيط الضوء التي يتم تحفيزها بواسطة الليزر المنبعث من خلال الألياف البصرية المزروعة، ولكن يتطلب التلاعب واسعة النطاق، وتكلفة كبيرة، والعمليات الجراحية المعقدة11. علم الوراثة الكيميائية ينطوي على تسليم الجسيمات الفيروسية التي ترميز مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل الأدوية مصمم أو DREADDs، والتي يتم تفعيلها في وقت لاحق من قبل ليجان محددة وخاملة بيولوجيا المعروفة باسم كلوزابين N-أكسيد (CNO)12 . ميزة استخدام DREADDs للتعامل مع الدوائر العصبية المحلية التي تنظم NSCs الكبار يكمن في سهولة وطرق مختلفة من إدارة CNO. وهذا يسمح لنهج أقل استهلاكا للوقت مع انخفاض التعامل مع الحيوانات، والتي هي قابلة للتكيف بسهولة للدراسات على المدى الطويل لتعديل الدوائر العصبية.
النهج الموصوف في هذا البروتوكول هو مجموعة شاملة من مختلف البروتوكولات المطلوبة لاستجواب بنجاح تنظيم الدائرة من تكوين الأعصاب فرس النهر الكبار الذي يجمع بين كل من تقنيات الفلورة المناعية والتلاعب الدائرة باستخدام علم الوراثة الكيميائية. الطريقة الموصوفة في البروتوكول التالي مناسبة لتحفيز أو تثبيط دائرة واحدة أو متعددة في وقت واحد في الجسم الحي لتحديد وظيفتها التنظيمية على تكوين الأعصاب الكبار. وأفضل استخدام لهذا النهج هو إذا لم تكن المسألة بحاجة إلى درجة عالية من الدقة الزمنية. الأسئلة التي تتطلب السيطرة الزمنية الدقيقة للتحفيز / تثبيط على تردد معين، يمكن معالجتها بشكل أفضل باستخدام علم الوراثة البصرية13،14. النهج الموصوف هنا يتم تكييفه بسهولة للدراسات طويلة الأجل مع الحد الأدنى من التعامل مع الحيوانات خاصة عندما يكون الإجهاد مصدر قلق كبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نورث كارولينا تشابل هيل على جميع الإجراءات بما في ذلك المواضيع الحيوانية.
1. حقن مجسمة من الجسيمات الفيروسية
- تحديد الدوائر العصبية المعنية. هذا سوف يحدد الفيروس وخط الماوس المستخدمة للإجراء التالي.
ملاحظة: على سبيل المثال، يتم تحفيز إسقاطات الخلايا الطحلبية التعارضية لتحليل آثارها على تكوين الأعصاب للبالغين. يتم تسليم الجسيمات الفيروسية ترميز AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry إلى المدير ية من 5ht2A-Cre الفئران15. - إدارة ميلوكسيكام (5 ملغ / كغ، تحت الجلد) ما لا يقل عن 30 دقيقة قبل العملية لتوفير التسكين الوقائي ل8 أسابيع من الذكور heterozygous 5ht2A-Cre الماوس.
- تخدير الماوس باستخدام خليط الأكسجين isoflurane 4٪ حتى يتباطأ التنفس والفأر فاقد الوعي باستخدام غرفة isoflurane. اصبع القدم قرصة الماوس للتأكد من أنها ليست مستجيبة.
- وضع الماوس في stereotax على وسادة التدفئة الحيوانية الصغيرة لتنظيم الحرارية وتطبيق زيوت التشحيم العين على كل عين. تقليل isoflurane إلى 1.5٪ مرة واحدة الحيوان هو داخل stereotax.
ملاحظة: وضع شريط الأذن خلال هذه المرحلة مهم. تأكد من أن الرأس هو مستوى بعد وضع شريط الأذن. ويمكن الاطلاع على تعليمات أكثر تفصيلا في Geiger وآخرون16. - ضع منتج إزالة الشعر على الرأس واتركه الجلوس لمدة تصل إلى 1 دقيقة كحد أقصى. إزالة الشعر عن طريق مسح الرأس مع مناديل الإيثانول. إذا لم تتم إزالة الشعر تماما، كرر هذه العملية حتى الجزء العلوي من الرأس هو أصلع.
- تطهير المنطقة أصلع مع محلول اليود البوفيدون 3 مرات على الأقل.
- وضع محلول ليدوكائين موضعي على الجلد أصلع من الرأس والانتظار لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: يقرص الفأر ة لضمان تخديره بالكامل قبل إجراء أي شقوق. - سحب فروة الرأس وتنظيف النسيج الضام على الجزء العلوي من الرأس باستخدام مسحات القطن معقمة حتى يمكن التعرف على بريجما بسهولة.
- حدد موقع bregma وضبط الرأس بحيث بريجما ولامدا كلاهما في نفس الطائرة عن طريق وضع الحفر في كلا الإحداثيات وضمان محاذاة. بالإضافة إلى ذلك، محاذاة نصف الكرة الأيسر والأيمن عن طريق وضع الحفر إلى اليسار / اليمين من منطقة بين بريجما ولامدا.
ملاحظة: وهذه الخطوة هامة جدا؛ وضع الرأس محاذاة بشكل غير صحيح سوف تعطل إحداثيات stereotaxic. - قم بالحفر في الإحداثيات التالية من bregma باستخدام بت حفر 0.5 مم: المحور الخلفي الأمامي (AP) -2.00 مم، المحور الجانبي الوسيط (ML) +1.50 مم.
ملاحظة: تعديل هذه الخطوة مع إحداثيات خاصة بالدائرة المعنية. يستهدف هذا المثال سايروس دينتات أحادي الذي يحتوي على خلايا طحلبية ويحدد تأثيرها على الخلايا الجذعية العصبية للبالغين على الجانب المقابل. - قم بالتبديل إلى حقنة 5 ميكرولتر وإبرة 26−33 G. صفر في بريما ثم حقن في الإحداثيات التالية عن طريق وضع الإبرة في ثقب الحفر في المحور الخلفي الأمامي -2.00 ملم، المحور الجانبي الوسيط -1.50 ملم، المحور البطني الظهري -2.3 مم.
- ضخ 500 نل من الفيروس المرتبط بالأدينو (AAV) من نواة فيروسية أو مصدر تجاري إلى نصف الكرة الأرضيةالمناسب، عند 50-100 نل/دقيقة باستخدام مضخة ضخ (جدول المواد). انتظر ما لا يقل عن 5 دقائق بعد الحقن قبل إزالة الإبرة ببطء من الدماغ.
ملاحظة: قد تتطلب هذه الإحداثيات تعديل استناداً إلى عمر وحجم الماوس. بعض الأنماط المصلية الفيروسية لها أنماط انتشار مختلفة، فمن الأفضل إجراء تجارب تجريبية لاختبار الانتشار الفيروسي قبل تجربة كاملة. - تنظيف فروة الرأس والجلد حول شق باستخدام المالحة،ثم ختم شق باستخدام لاصق الأنسجة (جدول المواد) في حين عقد الجلد جنبا إلى جنب مع ملاقط. تنفيذ جميع الإجراءات بعد العملية الجراحية مثل الرصد أثناء الانتعاش على منصة التدفئة حتى يكون الماوس نشطا، وتطبيق مسكن على الجرح، وإعطاء المسكنات لمدة يومين.
ملاحظة: تتطلب العديد من التجارب وقت انتظار لمدة أسبوعين أو أربعة أسابيع بعد التسريب الفيروسي للتعبير الفيروسي السليم.
2. إدارة أكسيد ن كلوزابين
- إعداد محلول CNO الأسهم عن طريق حل 10 ملغ من CNO في 100 درجة مئوية من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) والدوامة.
ملاحظة: إذا كان الحل لا يذوب تماما، وزيادة حجم DMSO، ولكن الكثير DMSO قد تجعل المياه مريرة. لا تتجاوز 0.1٪ DMSO في محلول المياه CNO أو أكثر من 200 درجة مئوية من DMSO لحل 200 مل. يمكن تخزين محلول مخزون CNO عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. - إضافة 10-50 درجة مئوية من 10 ملغ/100 ميكرولتر محلول مخزون CNO إلى كل 200 مل من الماء لتركيز نهائي 1-5 ملغ/200 مل. إعداد خليط المياه CNO الطازجة كل يوم.
ملاحظة: وقد استكملت بعض المجموعات ما يصل إلى 1٪ السكرين في الماء لإخفاء المرارة إذا كانت الفئران تمتنع عن الشرب. وأظهرت الدائرة التي تم التحقيق فيها استجابة مختلفة استنادا إلى مدى التنشيط. بشكل عام، 1 ملغ CNO/200 مل يكفي لتحفيز معظم الدوائر17. - ضع حل CNO في حاوية محمية مغطاة أو خفيفة عند تناوله للفئران بعد أسبوعين من التعافي من الحقن المجسم من الخطوة 1.13 على مدى فترة 4 أيام.
ملاحظة: CNO حساسة للضوء; تقليل التعرض للضوء خلال العملية بأكملها. - قياس وتسجيل استهلاك هادىن المياه حل المياه كل يوم عند إعداد محلول CNO الطازجة. في المتوسط، سوف تستهلك الماوس الكبار حوالي 4 مل من خليط المياه CNO. بالإضافة إلى ذلك، تسجيل وزن الماوس يوميا للتأكد من أنهم يشربون.
- تأكد من استخدام الضوابط المناسبة لكل تجربة. تضمين كل من CNO وDREADD التحكم. ومن الأمثلة على الإعداد التجريبي: (1) مركبة + مركبة برمائية مستقلة (AAV) مع مراسل الفيروسية لا DREADD، (2) CNO + AAV مع مراسل الفيروسية لا DREADD، و (3) CNO + AAV DREADD.
ملاحظة: تتضمن جميع المجموعات DMSO في الحل. لا يتم تضمين ضوابط DMSO لأن الحيوانات تتلقى أقل من 0.1٪ DMSO، والتي لم يثبت أن لها آثار سلبية على الخلايا الجذعية العصبية الكبار في الفئران. إذا كانت هناك مخاوف بشأن استخدام DMSO في مياه الشرب، إضافة إضافية لا DMSO والسيطرة المالحة.
3. الثيميدين التناظرية وضع العلامات
-
في يوم جمع الأنسجة، بعد 4 أيام من إعطاء CNO، تسمية الخلايا الانتشار عن طريق تنفيذ سلسلة من الثيميدين التناظرية، 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (إيدو) الحقن داخل اقناقان.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول Edu. ومع ذلك، هناك العديد من النظائر الثيميدين التي يمكن أن تسمية بكفاءة تكاثر مجموعات الخلايا بما في ذلك بردو، Idu، وسيدو8.- وزن إدو وتذوب في الصف البيطري 0.9٪ محلول حقن كلوريد الصوديوم في 4 ملغ / مل عن طريق الدوامة ووضع على الدوار لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: نظائر الثيميدين سامة وحساسة للضوء. اتبع أوراق بيانات سلامة المواد (MSDS) عند التعامل مع وغطاء الحل من التعرض للضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. - إدارة إدو داخل الصفاق في 40 ملغ / كغ أو 0.1 مل / 10 غرام من وزن الجسم من 4 ملغ / مل إدو الحل 4 مرات كل 2 ساعة.
ملاحظة: جرعات فوق 50 مغ/كغ تصل إلى مستويات التشبع تقريبا، ولن تزيد من كمية الخلايا المتكاثرة المسمى بشكل كبير18. من الأهمية بمكان أن تتلقى جميع الفئران نفس الكمية من حقن إدو لأن وضع العلامات غير السليم يمكن أن يؤدي إلى انحراف النتائج.
- وزن إدو وتذوب في الصف البيطري 0.9٪ محلول حقن كلوريد الصوديوم في 4 ملغ / مل عن طريق الدوامة ووضع على الدوار لمدة 15 دقيقة.
4. إعداد الأنسجة ومعالجتها
- بعد ساعتين من حقن إدو الأخير، تخدير الماوس باستخدام غرفة isoflurane حتى يتم تقليل التنفس بشكل كبير وقرصة اصبع القدم لضمان أن يتم تخديره تماما.
- تأمين الماوس إلى السطح باستخدام الإبر وجعل شق صغير تعريض القلب. أدخل إبرة 25 غرام إلى الأبهر الأيسر واقطع البطين الأيمن للتسريب عبر الكارديال مع محلول ملحي مُحَرَّف بالفوسفات (PBS) بمعدل تدفق 1-4 مل/دقيقة حتى يتم تطهير أنسجة الكبد.
- قم بتبديل محلول التسريب إلى 4% من البارافورمالهايد (PFA) وضخ حوالي 15-20 مل لإصلاح أنسجة الدماغ.
ملاحظة: ويمكن الاطلاع على تعليمات أكثر تفصيلا بشأن عملية التسريب في Gage et al.19. سيتم ملاحظة الهزات الحيوانية عند القيام به بشكل صحيح. - إزالة الرأس باستخدام زوج من مقص كبير ومن ثم إجراء سلسلة من الشقوق الدقيقة لتحرير الدماغ من الجمجمة. تخزين أنسجة الدماغ في 4 درجة مئوية في 4٪ PFA بين عشية وضحاها لمواصلة تحديد.
- إزالة أنسجة الدماغ من محلول PFA 4٪ ووضعها في محلول السكروز 10٪ في PBS لحماية الأنسجة بالتبريد لمدة 24 ساعة عند 4 درجة مئوية. ثم نقل الأنسجة إلى 30٪ السكروز PBS الحل لمدة 24 ساعة أخرى في 4 درجة مئوية قبل القسم.
ملاحظة: سوف تغرق أنسجة الدماغ في السكروز عندما تكون جاهزة لقسم microtome. يمكن تخزين أنسجة الدماغ على المدى الطويل في 30٪ السكروز. - قسم أنسجة الدماغ coronally في 40 أقسام ميكروم باستخدام ميكروتومي. جمع أقسام بدءا من بداية سايروس dentate، حوالي -1.20 ملم من بريما، وتنتهي بعد لوحة كاملة مع القسم الأول يجري الأكثر أمامية والقسم الأخير هو الأكثر الخلفي. استشارة أطلس الدماغ الماوس لتحديد بدقة المديرية العامة والبدء في تنسيق جمع الأنسجة.
- تخزين بشكل تسلسلي كل قسم في صفوف من 6 فيلوحة بئر 48 مليئة محلول مضاد للتجمد (الجدول 1).
| الحل المضاد للتجمد | الإثيلين غليكول 150 مل + سكروز 150 جم + تعبئة إلى 500 مل 0.1 م PB للحل 500 مل |
| المخزن المؤقت لسترات عند السمرة | 9 مل من مخزون حامض الستريك + 41 مل من تريفة سيترات ثلاثي الصوديوم + 450 مل من ddH2O |
| مخزون حامض الستريك | [0.1 م] حامض الستريك 21 جم/1 لتر دي إتش2س |
| ثلاثي الصوديوم سيترات الأسهم | [0.1 م] سترات ثلاثي الصوديوم 29.4 جم/1 لتر دي دي إتش2O |
| تريس المخزنة المالحة -تريتون (TBS-تريتون) | 0.05٪ 100-x تريتون في TBS |
| المخزن المؤقت للنفاذية | 0.5٪ 100-X تريتون في TBS |
| حظر المخزن المؤقت | 0.33 مل سيروم حمار في 10 مل TBS-تريتون |
| إدو رد فعل الحل | جعل حل CuSO4·5H2O عن طريق إضافة 1 ملغ من كوسو4·5H2O في حل 4 مل من [0.1 M] تريس درجة الحموضة 8.5. ثم إضافة 1:40 من 600 μM Alexa488-azide الحل و 10 ملغ / مل من L-Na+ أسكوربات إلى حل CuSO4·5H2O قبل تطبيقها على الأنسجة. |
الجدول 1: الحلول المستخدمة في الكيمياء المناعية.
5. الكيمياء المناعية
- بروتوكول عائم أساسي
ملاحظة: إذا تلطيخ العش، تخطي المقطع 5.1 ثم انتقل إلى القسم 5.2. البروتوكول العائم الأساسي هو لTbr2 أو doublecortin (DCX) فقط دون الثيميدين التناظرية إدو تلطيخ.- نقل المقاطع من الحل المضاد للتجمد إلى المالحة التي يتم تخزينها من قبل Tris (TBS) بترتيب تسلسلي في لوحة بئر 48.
- اغسل المقاطع مرتين في TBS-triton (0.05٪ TBS-triton، الجدول1) لمدة 5 دقائق عن طريق aspirating الحل في كل مرة أثناء الهز أو على الروك بسرعات بطيئة.
- نفاذ المقاطع باستخدام المخزن المؤقت للنفاذية (0.5٪ TBS-triton، الجدول1) لمدة 20-30 دقيقة في حين تهتز بسرعات بطيئة.
- جعل العازلة حظر عن طريق إضافة 0.33 درجة مئوية من مصل الحمار إلى 10 مل من TBS-تريتون. جعل الطازجة واستخدامها في غضون 3 أيام.
- تخزين التخزين المؤقت وأقسام الحضانة في حظر العازلة لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- جعل الحل الأساسي الأجسام المضادة في حظر المخزن المؤقت وإضافة إلى كل بئر. 500 درجة مئوية / جيدا يكفي لجميع أقسام الأنسجة لتكون مغمورة تماما. احتضان بين عشية وضحاها في RT على الروك أو شاكر.
- أسطيك الحل وشطف المقاطع في TBS-تريتون 3X لمدة 10 دقيقة لكل منها لإزالة آثار الأجسام المضادة الأولية.
- حضانة في الفلوروفور مترافق الأجسام المضادة الثانوية ضد الأجسام المضادة الأولية أعدت في منع الحل العازلة لمدة 2 ح في RT على الروك.
- غسل أقسام 3X لمدة 5 دقائق لكل في TBS-تريتون ومن ثم أقسام الحضانة في 4′,6-دياميديينو-2-فينيليندول (DAPI) الحل (300 درجة مئوية الحل في 1:100) المخففة في PBS لمدة 15 دقيقة.
- اغسل المقاطع 3x في أقسام PBS وmount التي تحافظ على ترتيب تسلسلي من الأمامي إلى الخلفي على شريحة مشحونة بشكل إيجابي. دع الأنسجة تجف في RT حتى تختفي الرطوبة بشكل واضح، عادة حوالي 2-5 دقائق، قبل أن تُغطّى بالوسائط المتصاعدة.
- مستضد الاسترجاع
ملاحظة: هذا المقطع مطلوب للعش في فقط. إذا تلطيخ العش، قم بتنفيذ هذا القسم قبل تلطيخ الثيميدين التناظرية (القسم 5.3). تخطي لTbr2 أو DCX تلطيخ مع إدو.- ضع مقاطع الأنسجة في PBS وقم 5-8 أقسام على شريحة مشحونة بشكل إيجابي مع الحفاظ على النظام التسلسلي من الأمامي إلى الخلفي. دع مقاطع الأنسجة تجف في RT لتلتصق بالكامل بالشرائح، التي تستغرق حوالي 2-5 دقائق.
- إعداد المخزن المؤقتللسيترات (الجدول 1) في حاوية، وعادة ما يكون مربع طرف ماصة 1000 ميكرولتر.
- يُسخّن حاجز السيترات في فرن ميكروويف (1000 واط) لمدّة 5 دقائق حتّى يغلي الحلّ. في حين أن الحل هو التدفئة، ووضع الأقسام التي شنت في 20 الشريحة حامل الشريحة الشريحة. بعد 5 دقائق، وضع بعناية حامل الشريحة مع أقسام في مربع ماصة.
- اضبط يُعد ّ قدرة فرن الميكروويف على 50% ويُطهى لمدة 7 دقائق. خلال هذه الدقائق 7، وقف الميكروويف عندما يبدأ الحل ليغلي ومواصلة الميكروويف بعد توقف الغليان.
ملاحظة: والهدف من هذه الخطوة هو الحفاظ على درجة حرارة المياه الحق تحت درجة حرارة الغليان لمدة 7 دقائق. ويمكن الاطلاع على تعليمات أكثر تفصيلا في الحسيني وآخرون20. - إخراج مربع دافئ مع حاجز سيترات والشرائح الأنسجة ووضعها في دلو الجليد لتبرد. تغطية لمنع الجليد أو غيرها من المواد من دخول الحل. انتظر حوالي 30 دقيقة أو حتى يصبح الحل رائعًا للمسه.
- انتقل إلى الثيميدين التناظرية تلطيخ الخطوة 5.3.2 إذا كنت تستخدم التناظرية الثيميدين.
- الثيميدين التلطيخ التناظرية
ملاحظة: تبدأ من هنا إذا تلطيخ Edu و Tbr2 أو Edu و DCX.- ضع مقاطع الأنسجة في PBS وسلسلة 5-8 على شريحة مشحونة بشكل إيجابي مع الحفاظ على النظام التسلسلي من الأمامي إلى الخلفي ونفس الاتجاه. دع مقاطع الأنسجة تجف لتلتصق تماماً بالشرائح ثم ارسم حدوداً باستخدام قلم أو قلم PAP.
- نفاذ المقاطع مع المخزن المؤقت نفاذيبيليت (0.5٪ TBS-تريتون) لمدة 20-30 دقيقة. ثم غسل أقسام 2X باستخدام TBS-تريتون لمدة 5 دقائق لكل منهما.
ملاحظة: يساعد الانقبة على اختراق الأجسام المضادة داخل الخلايا. يمكن تعديل وقت نفاذية اعتمادا على سمك الأنسجة وكفاءة الأجسام المضادة. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن يزيد من تركيز المنظفات لزيادة فعالية نفاذية. ومع ذلك، ينبغي الحرص على عدم النفاذ لفترة طويلة جدا ً حيث تزداد هشاشة الأنسجة مع طول فترة نفاذية. - إعداد حل رد فعل إدو وفقا للجدول 1. التركيز النهائي من Alexa488-azide هو 15 درجة مئوية في 1 مل من محلول رد فعل إيدو.
- أقسام الحضانة في محلول رد فعل إدو لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة ثم يغسل 3X في TBS-تريتون لمدة 5 دقائق لكل منهما. تغطية الشرائح في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء بعد هذه الخطوة. في هذه المرحلة تحقق مما إذا كان رد فعل إدو يعمل باستخدام المجهر الفلورسنت. سوف الخلايا التي تحمل اسم Edu الفلورية تحت مجهر الظهارة.
- شنت بروتوكول قسم الأنسجة
- كتل أقسام الأنسجة شنت على شريحة من الخطوة 5.3.4 باستخدام حاجز حظر أثيرت في نفس الحيوانات مثل الأجسام المضادة الثانوية، على سبيل المثال، مصل الحمار، لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة ثم يغسل 2X في TBS-تريتون لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- إعداد حل الأجسام المضادة الأولية (أي الدجاج المضادة للعش) أثناء خطوة حظر عن طريق خلط الأجسام المضادة الأولية في حظر الحل العازلة في 1:200. 250 ميكرولتر لكل شريحة كافية لضمان أن الأنسجة مغمورة تماما في الحل.
- احتضان أقسام الأنسجة في محلول الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في RT بعد حجب الغسول. تعديل هذه الخطوة استناداً إلى الأجسام المضادة الأساسية المستخدمة.
ملاحظة: إذا كانت الأجسام المضادة ذات خلفية عالية أو ملزمة غير محددة، فإن الحضانة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية بدلاً من RT قد تحسن النتائج. يمكن ترك الأجسام المضادة مع ضعف اختراق الأنسجة لاحتضان لمدة 2 أيام إذا لزم الأمر. - أقسام الأنسجة الحاضنة 3x في TBS-تريتون لمدة 5 دقائق لإزالة الأجسام المضادة الأولية الزائدة. ثم احتضان أقسام الأنسجة في الأجسام المضادة الثانوية المترافقة فلوروفور (أي اليكسا 647 المضادة للدجاج في 1:200) أعدت في منع حل العازلة لمدة 2 ساعة في RT.
- أقسام الأنسجة الحاضنة 3x في TBS-تريتون لمدة 5 دقائق لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة وتطبيق 300 μM DAPI الحل في 1:100 في PBS لمدة 15 دقيقة في RT.
- نقل أقسام الأنسجة 3x في PBS لمدة 5 دقائق لإزالة DAPI الزائدة وإزالة دائرة قلم عنق الرحم من حول الأنسجة باستخدام مسحة القطن أو مسح مهمة حساسة. السماح للأقسام الجافة ومن ثم تطبيق تصاعد وسائل الإعلام وزلة غطاء. السماح للوسائط المتصاعدة بالجفاف قبل تصوير الشرائح.
6. مجموعة الصور
- مجموعات تجريبية عمياء من مجموعات التحكم من خلال تغطية تسميات الشرائح وصورة نفس الجانب من DG باستخدام المجهر البؤري (جدولالمواد)مع 40X عدسة بصرية التكبير النفط في حجم خطوة 1 ميكرومتر أو التكبير 20X 2X في 1 ميكرومتر.
ملاحظة: و40x التكبير النفط تعطي زيادة القرار ولكن يستغرق وقتا أطول من التكبير 20X 2X. - تعيين عدسة الهدف إلى 40x ثم انقر على علامة التبويب تحديد موقع في الزاوية اليسرى العليا في البرنامج البؤري (جدولالمواد)وتعيين المقطع DG المطلوب في منتصف مجال العرض.
- حدد موقع DG، ثم قم بالتبديل إلى علامة التبويب الاكتساب في الزاوية العلوية اليسرى، وتحقق من المربعات التالية: Z-stack،والمسح الضوئي للتجانب،والموضع .
- تعيين إعدادات القناة بين 600-750 كسب، 1٪-15٪ كثافة الليزر، و1-10 إزاحة. لا تتجاوز كثافة الليزر 20٪ لأي من القنوات. تأكد من عدم فرط تشبع أي بيكسلات عند إعداد الكسب والكثافة.
ملاحظة: وسوف تختلف هذه النطاقات اعتمادا على كفاءة المعدات المستخدمة وكفاءة تلطيخ. - قم بتعيين التجانبات إلى 7 أفقية بمقدار 3 عمودية في نافذة فحص التجانب واضغط على صورة نظرة عامة على المسح الضوئي باستخدام نفس الإعدادات المستخدمة حاليًا. على سبيل المثال، استخدم 7 أفقي بواسطة 3 عمودي والهدف 20x مع التكبير/التصغير مرتين.
- تأكد من أن المدير ية تماما ضمن الصورة المتوقعة بعد مسح نظرة عامة. إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بضبط طريقة عرض المديرية العامة حتى تكون تماماً في صورة النظرة العامة لأن هذه صورة تمثيلية سيتم الحصول عليها.
- قم بتعيين عمق التصوير عن طريق التمرير عبر مكدسات Z مختلفة باستخدام مقبض التركيز البؤري الدقيق. تأكد من أن المديرية العامة بأكملها ضمن نقاط البداية والنهاية. على افتراض حجم خطوة 1 ميكرومتر، يجب أن تكون كل صورة حوالي 40 خطوة.
- قم بتعيين سرعة المسح الضوئي إلى 9 باستخدام المسح الضوئي ثنائي الاتجاه وعدم وجود متوسط في نافذة وضع الاكتساب. ثم أضف موضعًا في إطار الموضع.
ملاحظة: كرر الخطوات 6.3-6.8 لتصوير عدة أهداف التنمية في وقت واحد. تؤدي زيادة سرعة المسح الضوئي إلى خفض جودة الصورة ولكنها تقلل من وقت التصوير بشكل عام. إذا كانت جودة الصورة منخفضة جدًا، فقلل من سرعة المسح الضوئي أو زيادة المتوسط. - انقر فوق زر بدء التجربة عندما تكون جاهزة. مسح 5 أقسام من DG لكل ماوس على طول المحور الأمامي إلى الخلفي. على سبيل المثال، إذا تم تصوير DG الأيسر للقسم الأول، صورة المديرية العامة التالية الأكثر الخلفية للقسم الثاني.
- غرزة صور منفصلة معا لتشكيل صورة كاملة من gyrus dentate باستخدام ميزة غرزة تحت علامة التبويب عملية في البرنامج confocal. بدلا من ذلك، استخدم فيجي (ImageJ) لغرزة الصور معا لتشكيل سايروس dentate كاملة.
- حفظ الصور مخيط للقياس الكمي.
7. تحليل الصور
- فتح كل صورة من كل قسم سايروس dentate باستخدام فيجي كإسقاط الحد الأقصى وكصورة مركبة مع القنوات دمجها في ألوان متميزة لتصور بسهولة التعريب.
- قياس مساحة المديرية العامة لكل مقطع من صورة الإسقاط القصوى باستخدام أداة تحديد المضلع (المربع الثالث من اليسار) وتسجيل كل مقطع من كل ماوس. وستكون هذه هي منطقة المديرية العامة المستخدمة لحساب الكثافة.
- تسجيل عدد الخلايا في DG من الصورة المركبة التي لديها colocalizing الأجسام المضادة الأولية (أي nestin) وthymidine التناظرية إدو، وذلك باستخدام عداد الخلية المساعد فيجي وجدت تحت الإضافات | تحليل | عداد الخلية | عداد الخلية. بالإضافة إلى ذلك، قم بتسجيل العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية وخلايا العش الإيجابية Edu مع عملية شعاعي.
ملاحظة: في حالة العش، من المهم جدا أن تولي اهتماما للمورفولوجيا. إذا كان قياس الخلايا الجذعية العصبية، تأكد من أن الخلايا فقط مع عملية شعاعي يتم قياسها كميا. عند قياس أقسام الجبس، قم بتطبيق نفس المعايير على الجميع، خاصة عند تصور الخلايا خارج مستوى بؤري. إذا لم تكن الخلايا ضمن المستوى البؤري، فلا تحسبها. يرجى الاطلاع على West et al.21 للحصول على تعليمات أكثر تفصيلا ً بشأن القياس الكمي الاستريو. - أدخل عدد الخلايا في برنامج جدول بيانات لتجميع كافة أجزاء البيانات لتحليلها لاحقًا.
- حساب كثافة الخلايا المجمعة لكل مقطع عن طريق قسم العدد الإجمالي للخلايا المجمعة حسب الحجم الإجمالي لكل مقطع في كل مقطع. على سبيل المثال، الحصول على كثافة الخلايا الجذعية عن طريق تقسيم مجموع خلايا nestin+/edu+ في أحد الحيوانات على مجموع حجم المديرية العامة في أحد الحيوانات. حساب حجم كل مقطع عن طريق ضرب المساحة بزيادات إجمالية لـ Z-step على افتراض أن كل خطوة هي 1 ميكرومتر.
ملاحظة: وفي هذا البروتوكول، ينبغي أن يكون مجموع الخطوات قريباً من 40، نظراً إلى أن الأنسجة تُقسم بمقدار 40 متراً، وضمان أن يكون كل الحيوان نقطة بيانات لأن الهدف من هذا النهج هو تقدير الكمية الإجمالية للخلايا المشتركة في نصف الكرة الأرضية من فرس النهر. - إجراء عمليات حسابية ضرورية إضافية للسؤال الذي يحاول أحدهم معالجته. في هذا المثال، حساب العدد الإجمالي للخلايا المتكاثرة، ومجموع عدد الخلايا الجذعية، والنسبة المئوية للخلايا الجذعية المنتشرة بعد تحفيز الخلايا الطحلبية المناوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد الإجراءات التجريبية المذكورة أعلاه (الشكل1A،B) ، تمكنا من تحديد آثار تحفيز إسقاطات الخلايا الطحلبية التعارضية على محراب الأعصاب داخل الحصين. من خلال استخدام فيروس "كيكيو" الذي يعتمد على "كري" و"تحفيز" و"DREADD" المقترن بخلية طحلبية تحمل علامة 5-HT2A Cre-line، تمكنا من تنشيط الإسقاطات المحفزة بشكل انتقائي من الخلايا الطحلبية على الـ DG المضادة وقررنا أن الخلية الطحلبية القوية تعزيز التحفيز تنشيط الخلايا الجذعية (الشكل1C). تحققنا من التسليم الفيروسي الدقيق قبل تحليل الأنسجة (الشكل2A،B). بالإضافة إلى ذلك، قمنا بالتحقق من تنشيط الخلايا الطحلبية عن طريق تجارب الكيمياء المناعية c-fos (لم تظهر البيانات). في حالة الحقن الفيروسي غير السليم، استبعاد الحيوان من مزيد من التحليل. الحقن غير السليم هو الذي يفشل في استهداف الإحداثيات المطلوبة، لديه معظم التعبير خارج المنطقة المطلوبة، أو لديه القليل من أي تسليم الفيروسية. لهذه التجربة، كانت الخلايا الطحلبية في الجزء من المديرية العامة هي الهدف المقصود، وإذا كانت الحقن خارج الهالة، تم استبعادها. باستخدام التناظرية الثيميدين، إدو، واسترجاع مستضد لتلطيخ العش المبينة في القسمين 5.2 و 5.3، كنا قادرين على تسمية بنجاح انتشار الخلايا الجذعية العصبية (الشكل3A). بالإضافة إلى ذلك، عن طريق حذف خطوة استرجاع مستضد، القسم 5.2، كنا قادرين على تسمية Tbr2 السلف العصبي الإيجابي وneuroblast، وDCX العصبية الإيجابية والخلايا العصبية غير ناضجة (الشكل3A). نعرض مثالاً على المنطقة الكمية والمستخدمة لحساب الكثافة وتقديم مثال للأنسجة المُثبتة على شريحة (الشكل3B والشكل 4A). وعلاوة على ذلك، تقدم التجارب الناجحة والتجارب دون المستوى كمراجع للنهج التجريبية (الشكل4باء). وأخيرا، هناك العديد من التجزّزات المختلفة التي يمكن الحصول عليها من تجربة ناجحة (الشكل 5A-D)15. وتشمل التجزّزات الكمية كثافة الخلايا الجذعية العصبية المتكاثرة (Nestin+/Edu+/volume)، ونسبة تكاثر الخلايا الجذعية العصبية (Nestin+/Edu+/total nestin)، والخلايا المتكاثرة الإجمالية (Edu+/volume) ومجموع تجمع الخلايا الجذعية (Nestin+/volume) ). عند التحفيز التعارضي للخلايا الطحلبية ، لوحظ انخفاض في انتشار الخلايا الجذعية العصبية. ويمكن الحصول على كمية مماثلة للذرية العصبية والخلايا العصبية غير ناضجة باستخدام الأجسام المضادة المناسبة.
الشكل 1: النهج التجريبي لتنظيم دوائر التبيّن للخلايا الجذعية العصبية للبالغين. (أ) تخطيطي يمثل الخطوات المختلفة الموضحة في البروتوكول. (ب) الجدول الزمني للنهج التجريبي المستخدم لتحفيز الخلايا الطحلبية في القوارض. (C) حقن التخطيطياستهداف الخلايا الطحلبية المقابلة للتحفيز. (د) مخطط النسب التنموي للخلايا الجذعية العصبية البالغة في المنطقة تحت الحبيبية (SGZ)، طبقة الخلايا الحبيبية (GCL)، والطبقة الجزيئية (ML) مع الأجسام المضادة المقابلة المستخدمة في مراحل التنمية المختلفة. وتشمل المراحل التنموية المختلفة إما الخلايا الجذعية العصبية الشعاعية (NSC) هادئة أو نشطة، والprogenitors العصبية (NP)، neuroblast (NB)، وخلايا الحبيبية غير الناضجة (GC)، وGC ناضجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إثبات الولادة الفيروسية الفعالة. (أ) صور الفلورة المناعية للتسليم الفيروسي الدقيق. الجسيمات الفيروسية تعبر عن تسمية الفلورسنت mCherry التي تستهدف الخلايا الطحلبية في الهالة (المنطقة البيضاء المحاصر). DAPI تسميات النوى الخلية. الجانب صورة من التسليم الفيروسي دقيقة يوضح واضحة إسقاطات الألياف الطحلبية من الجانب حقن contralateral. (ب) صور الفلورة المناعية من الحقن الفيروسية المستهدفة. لاحظ أنه في هذه الحالة الألياف الطحلبية المنافية غير موجودة في جانب الصورة. شريط مقياس = 50 درجة.
الشكل 3: تحليل تكاثر الخلايا الجذعية العصبية والذرية. (أ) صور الكيمياء المناعية من الثيميدين التناظرية إدو colocalizing مع علامات مرحلة الخلية محددة nestin (الخلايا الجذعية العصبية والذرية)، Tbr2 (الخلايا الجذعية العصبية، الذرية العصبية)، وDCX (neuroblast، الخلايا العصبية غير ناضجة) المشار إليها من قبل رؤوس الأسهم البيضاء. شريط مقياس = 10 ميكرومتر (ب) قياس تمثيلي للمنطقة داخل سايروس dentate المستخدمة لحساب الكثافة. شريط مقياس = 50 درجة.
الشكل 4: إظهار إعداد الفلورة المناعية. (أ) التخطيطية التي تبين الفصل الاستريولي لمقاطع الأنسجة المركبة من المحور الأمامي إلى المحور الخلفي. يشير المربع الأحمر إلى الصورة الجانبية. (ب) عرض تجارب ناجحة دون المستوى المناعي لعلامات النسب العصبية. شريط مقياس = 50 درجة.
الشكل 5: التنشيط التعارضي للخلايا الطحلبية يقلل من انتشار الخلايا الجذعية العصبية. (أ) التكميم الكمي للكيمياء المناعية لخلايا نيستين + / إدو + في سايروس dentate تظهر انخفاضا في الانتشار بعد تحفيز الخلايا الطحلبية المناوة. (ب) انخفاض في نسبة تكاثر الخلايا الجذعية العصبية في المجموعة مع الخلايا الطحلبية المنفعلة. (ج) لم يكن هناك أي تغيير كبير في كثافة الخلايا الجذعية العصبية في أي من المجموعتين. (د) لم يكن هناك أي تغيير في المستويات الإجمالية للخلايا المنتشرة في سايروس dentate. القيم تمثل يعني ± خطأ قياسي في القياس. p < 0.05 (n = 3 للتحكم، n = 5 لمجموعة hM3D). وقد تم تكييف هذا الرقم من يه وآخرون15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهدف من هذا البروتوكول هو تقييم كيفية التلاعب الدوائر العصبية محددة ينظم تكوين الأعصاب فرس النهر الكبار في الجسم الحي باستخدام سلسلة من تقنيات الكيمياء المناعية. تنظيم النشاط المعتمد على النشاط من تكوين الأعصاب الكبار بوساطة دوائر عصبية محددة هو تقنية قيمة مع إمكانية كبيرة لإجراء تعديلات لدراسة مجموعة متنوعة من الدوائر العصبية. نجاح هذه الأنواع من التجارب يعتمد على عوامل متعددة بما في ذلك التسليم الفيروسي الدقيق، واختيار الفيروسية المناسبة للتلاعب المطلوب، والتسليم السليم للنظير الثيميدين، وعمر الحيوان، وكفاءة تلطيخ المناعة، وناجحة التسريبات عبر الكرال، والقياس الكمي غير متحيزة من الصور. على سبيل المثال، قد يسبب التسليم الفيروسي غير الدقيق تأثيرات الهدف التي تؤدي إلى النمط الظاهري غير المرتبط بالدائرة المعنية. بالإضافة إلى ذلك، قد تخفي تقنيات الفلورة المناعية المنخفضة الجودة العدد الحقيقي للخلايا الحالية، وبالتالي تنتج نمطاً فينوائياً غير ذي صلة بيولوجياً. عامل آخر مهم جدا للسيطرة هو عمر الفئران عند إجراء التجارب، معتبرا أن تكوين الأعصاب الكبار هو العمر تعتمد22. وأخيرا، من المهم أن يتم تسجيل كل قسم بشكل غير متحيز. للحد من التحيز، واتخاذ نهج منهجي وضمان أن الشخص الذي يسجل يتقن في تحديد مراحل تطوير NSC الكبار باستخدام المعلومات المورفولوجية. بالإضافة إلى ذلك، أعمى كل من السيطرة والعلاج المجموعات والكشف عن هوياتهم بعد القياس الكمي الصورة. وكتدبير إضافي للحد من التحيز، يمكن لفردين منفصلين تحديد نفس مجموعة البيانات للتحقق من صحة النتائج الملاحظة.
وهناك عدة قيود مرتبطة بهذا النهج لدراسة تنظيم نشاط الدوائر المعتمدة على المراكز الوطنية للضمان اتّبعاً من البالغين وذرية حديثي الولادة. والقيد الأول هو أن هذا النهج لا يوفر معلومات عن أنواع الخلايا المحددة داخل الدائرة التي تتوسط في التأثير العام على NSCs من التلاعب الدائرة المعنية. وهذا يعني أنه على الرغم من أنه قد يكون هناك تأثير فينوتيبيك على الشركات NSCs الكبار، قد يكون التأثير يتصرف من خلال واحد أو عدة أنواع الخلايا المتوسطة. وهناك طريقة فعالة لمعالجة هذا القلق هو إقران هذه الدراسات مع الفيزيولوجيا الكهربائية لدبوس أسفل الوسطاء. وثمة قيد إضافي لهذا البروتوكول هو الحاجة إلى وجود خط معين من الفأر ة (5-HTR2A) أو بنية فيروسية (AAV5-camKII-hM3d-mcherry) يمكن أن تستهدف الدائرة المطلوبة. إذا كان خط الماوس Cre خلية فعالة محددة ليست متاحة بسهولة لمسألة ذات أهمية، والقدرة على دراسة هذه الدائرة يصبح من الصعب على نحو متزايد. ومع ذلك، العديد من أنواع الخلايا في الدماغ لديها خطوط الماوس محددة Cre. ويرتبط تقييد أقل من هذا البروتوكول إلى CNO كربط خامل فعال. في الآونة الأخيرة، أظهرت الدراسات أن CNO، والكيميائية الخاملة المستخدمة لتنشيط DREADDs، استقلاب إلى clozapine، والتي قد تسبب الأنماط الظاهرية السلوكية23. ومع ذلك، فإن الطريقة الفعالة لمعالجة هو تضمين عناصر التحكم المناسبة في كل تجربة. مثال على عناصر التحكم المناسبة يتضمن كل من التحكم CNO و DREADD، حيث يتم إدارة CNO في تركيبة مع فيروس مراسل التحكم (AAV5-DIO-mCherry)، وعنصر تحكم ملحي فقط حيث لا يتم إدارة CNO إلى مجموعة فيروس مراسل. عن طريق تضمين عناصر التحكم هذه، يمكن عزل تأثيرات CNO فقط. بدلا من ذلك, الرباط الخامل الثانوي المعروف باسم C21, وقد ثبت مؤخرا أن لها فعالية مماثلة وفعالية مع عدم وجود آثار سلوكية ثبت24. وأخيراً، فإن الحد النهائي لهذا البروتوكول هو التحكم في كمية CNO التي يستهلكها كل الحيوان أثناء التجربة. تشرب الحيوانات المختلفة المياه التي تحتوي على CNO بدرجات متفاوتة، وبالتالي قد يكون لها مجموعة من الآثار على تكوين الأعصاب للبالغين. بشكل عام، يميل الماوس إلى شرب حوالي 4 مل من مياه CNO في فترة 24 ساعة. وهذا يعني أنه في تركيز 1 ملغ/200 مل الحيوانات تتلقى ما مجموعه 0.02 ملغ من CNO يوميا وهو ما يشبه كمية جرعة واحدة CNO حقن داخل احيال. إذا كانت الإدارة المقترنة في الوقت المناسب من CNO هو مصدر قلق, التحول إلى الحقن داخل مجلس الإدارة قد يكون بديلاً أفضل.
ميزة استخدام هذا البروتوكول هو درجة الخصوصية التي تحققت عند تحوير تكوين الأعصاب الكبار. وقد استخدمت الدراسات السابقة تكوين الأعصاب الناهض الدوائية تدار بشكل منهجي أو خصم لتعديل مكونات الدائرة. هذه التلاعبات غير محددة قد تنتج الاختلافات phenotypic ولكن توفر القليل من البصيرة حول الآليات التي تنطوي على تنظيم الخلايا الجذعية العصبية الكبار. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة للتحقيق في مختلف الآثار واسعة الدائرة على تكوين الأعصاب الكبار. على سبيل المثال، عن طريق التحول إلى DREADD مثبطة، أو عن طريق استهداف واحد أو مناطق متعددة من الدماغ في وقت واحد، يمكن للمرء أن يسأل مجموعة من الأسئلة لفهم تنظيم دائرة محددة من تكوين الأعصاب الكبار. ميزة أخرى لاستخدام هذا البروتوكول على النهج السابقة هو أن استخدام الأجسام المضادة العشين يلغي تربية الحيوانات المعدلة وراثيا من مراسلي الخلايا الجذعية العصبية المشفرة الفلورسنت مثل nestin:GFP، وزيادة الكفاءة والحد من الوقت في التجربة8. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التقنية تحد من التعامل مع القوارض عند إعطاء CNO، مما يقلل من الإجهاد القوارض أثناء التجارب. من المهم تخفيف الضغط عند دراسة العمليات الحساسة للإجهاد. وأخيراً، يمكن تعديل هذا النهج بسهولة ليشمل اختبارًا سلوكيًا، على سبيل المثال، إذا كان المرء مهتمًا بالسؤال عما إذا كانت دائرة الخلايا الطحلبية المعوّلة التي تحوّل الـ NSCs تلعب أيضًا دورًا في التعلم المكاني أو القدرة على الإجهاد.
الصعوبة التقنية الرئيسية عند استخدام هذا النهج هو التسليم الفيروسي الدقيق. يصبح جراح القوارض يتقن يأخذ الممارسة ويمكن أن يستغرق استكشاف الأخطاء وإصلاحها كبيرة. ولذلك فمن المستحسن إجراء سلسلة من التجارب التجريبية لاختبار التتر الفيروسي، وكفاءة وضع العلامات، وانتشار الفيروسية. لقد وجدنا أن بعض الأنماط المصلية لها أنماط انتشار مختلفة وأن النمط المصلي AAV2 ينتشر أقل من AAV5 أو AAV8. بالإضافة إلى ذلك، فمن الأفضل أن يكون مزود التعبئة والتغليف الفيروسية موثوق بها لكل من هذه التجارب. من خلال إجراء العمليات الجراحية التجريبية، يمكن معالجة العديد من هذه المخاوف ويمكن للمرء أن يوفر الوقت. ومن المستحسن أيضا أن اختبار واحد تركيزات CNO مختلفة لتحفيز أو تثبيط الدوائر المطلوبة. بشكل عام، 1 مغ/كغ سوف تنشيط الدوائر اختبار بما فيه الكفاية، ولكن بعض أنواع الخلايا قد تتطلب أكثر أو أقل CNO. من المهم أن نلاحظ أن جرعة من إدارة CNO يمكن أن تؤثر بشكل تفاضلي على بعض الدوائر على وجه التحديد عند النظر في شيء مثل الخلايا الطحلبية15.
وتشمل التطبيقات البديلة لهذا البروتوكول الاختبار السلوكي المتزامن، وتعديل الدوائر البديلة، والتحليل الإضافي لسمات تكوين الأعصاب. لإجراء اختبار سلوكي، يمكن متابعة البروتوكول الموضح وبعد إدارة CNO، تنفيذ مهمة سلوكية معينة، مثل اختبار موقع جديد، أو مهمة تنقل مكاني. وتتمثل فائدة هذا النهج في أن تجربة واحدة من شأنها أن تسفر عن معلومات سلوكية ومعلومات محددة للدوائر يمكن أن تؤدي إلى نمط ظاهري سلوكي محدد للدائرة. لتعديل الدوائر البديلة، يمكن للمرء استخدام مزيج من خطوط Cre المختلفة وناقلات الفيروسية. على سبيل المثال، إذا كان المرء مهتما في فهم كيفية تثبيط الخلايا العصبية الدوبامين من منطقة تيغمينتال البطني (VTA) أو VTA يعدل تكوين الأعصاب الكبار، يمكن للمرء أن يستخدم خط الماوس هيدروكسيلاز كري التيروزين وحقن hM4D تعتمد على Cre (مثبطة) فيروس DREADD في إلى VTA لتحديد تنظيم الدوبامين محددة من تكوين الأعصاب الكبار. إمكانيات استهداف مناطق الدماغ البديلة باستخدام هذا النهج واسعة ويمكن استخدامها استراتيجيا لاستجواب الدوائر العصبية مقنعة. وأخيرا، يسمح هذا النهج للمرء أن يحقق في مراحل إضافية من تكوين الأعصاب الكبار. إن مثلا أراد واحدة أن يفهم كيف يحثّ خلايا طحلبة يأثر مشتل أو طول [دندريتيك] من خلايا عصبيّة غيرناضج, يتبع واحدة بروتوكول مماثلة غير أنّ ينجز تحليل بديلة مثل [هولّ] تحليل.
وباختصار، يوفر هذا البروتوكول عملية مفصلة خطوة بخطوة لدراسة تنظيم نشاط الدائرة المعتمدة على الشركات القومية الوطنية للبالغين والتكوين العصبي عن طريق تكنولوجيا DREADD. تكمن قوة هذا البروتوكول في قدرته على أن يتم تعديله بسهولة لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة المتعلقة بتنظيم الخلايا الجذعية العصبية للبالغين محددة. مع تقدم تكنولوجيا التكرارات القصيرة المتداخلة المتباعدة (CRISPR)، أصبح من الأسهل الآن توليد خطوط ماوس Cre محددة للخلايا لإقرانها ببنيات فيروسية متطورة لمعالجة الأسئلة المتزايدة التعقيد توسيع نطاق تطبيق هذا البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تلقى L.J.Q. الدعم من المعهد الوطني للصحة العقلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة في إطار ملحق التنوع R01MH111773، فضلا عن منحة تدريبية T32 T32T007431-20. تم دعم هذا المشروع من المنح المقدمة إلى J.S. من NIH (MH111773, AG058160, و NS104530).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Roth, B. L.
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
