Induzione e caratterizzazione dell'ipertensione polmonare nei topi utilizzando il modello Ipossia/SU5416
Summary
Questo protocollo descrive l’induzione dell’ipertensione polmonare (PH) nei topi in base all’esposizione all’ipossia e all’iniezione di un antagonista del recettore VEGF. Gli animali sviluppano PH e ipertensione ventricolare destra (RV) 3 settimane dopo l’avvio del protocollo. Viene presentata anche la caratterizzazione funzionale e morfometrica del modello.
Abstract
L’ipertensione polmonare (PH) è una condizione patofisiologica, definita da una pressione arteriosa polmonare media superiore a 25 mm Hg a riposo, come valutato dalla cateterizzazione del cuore destro. Un ampio spettro di malattie può portare alla PH, differendo nella loro eziologia, istopatologia, presentazione clinica, prognosi e risposta al trattamento. Nonostante i progressi significativi degli ultimi anni, la PH rimane una malattia non curata. Comprendere i meccanismi sottostanti può spianare la strada allo sviluppo di nuove terapie. I modelli animali sono importanti strumenti di ricerca per raggiungere questo obiettivo. Attualmente, ci sono diversi modelli disponibili per la ricapitolazione PH. Questo protocollo descrive un modello PH del mouse a due colpi. Gli stimoli per lo sviluppo di PH sono l’ipossia e l’iniezione di SU5416, un antagonista del recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Tre settimane dopo l’inizio dell’ipossia/SU5416, gli animali sviluppano rimodellamento vascolare polmonare imitando i cambiamenti istopatologici osservati nella PH umana (prevalentemente gruppo 1). Il rimodellamento vascolare nella circolazione polmonare comporta il rimodellamento del ventricolo destro (RV). Le procedure per misurare le pressioni del camper (utilizzando il metodo toracico aperto), le analisi morfometriche del camper (sezionando e pesando entrambi i ventricoli cardiaci) e le valutazioni istologiche del rimodellamento (sia polmonare valutando il rimodellamento vascolare che il cardiaco valutando l’ipertrofia e la fibrosi cardiomiociti RV) sono descritte in dettaglio. I vantaggi di questo protocollo sono la possibilità dell’applicazione sia in tipo selvaggio che nei topi geneticamente modificati, l’attuazione relativamente facile e a basso costo e il rapido sviluppo della malattia di interesse (3 settimane). Limitazioni di questo metodo sono che i topi non sviluppano un fenotipo grave e PH è reversibile al ritorno alla normasoia. La prevenzione, così come gli studi terapeutici, possono essere facilmente implementati in questo modello, senza la necessità di competenze avanzate (al contrario dei modelli di roditori chirurgici).
Introduction
L’ipertensione polmonare (PH) è una condizione patofisiologica, definita da una pressione media arteriosa polmonare (PA) superiore a 25 mm Hg a riposo, come valutato dalla cateterizzazione del cuore destro1,2. C’è una varietà di malattie che possono portare a PH. Nel tentativo di organizzare le condizioni associate al PH, sono stati sviluppati diversi sistemi di classificazione. L’attuale classificazione clinica classifica le molteplici malattie associate al PH in 5 gruppi diversi1. Questa distinzione è importante poiché vari gruppi di pazienti hanno malattie che differiscono nella loro presentazione clinica, patologia, prognosi e risposta al trattamento2. La tabella 1 riassume l’attuale classificazione, completata dalle caratteristiche istopatologiche di base di ogni malattia.
Tabella 1: Panoramica della classificazione clinica della PH, insieme alle principali caratteristiche istopatologiche all’interno dei gruppi. Idoneità del protocollo Hypoxia/SU5416 per la modellazione ph. Questa tabella è stata modificata da19. PH: Ipertensione polmonare, PAH: Ipertensione arteriosa polmonare
Nonostante i significativi progressi nel trattamento delle malattie associate al PH, la PH rimane ancora senza una cura, con un tasso di mortalità a 3 anni compreso tra il 20% e l’80%3. Ciò indica l’imperativo di comprendere i meccanismi sottostanti della PH e, successivamente, lo sviluppo di nuove terapie per prevenire, rallentare la progressione e curare la malattia. I modelli animali sono di fondamentale importanza per questo ambito. Attualmente, esistono vari modelli per studiare la PH. Il lettore interessato si riferisce alle ottime recensioni su questo argomento2,3,4. Tenendo presente la varietà di malattie che portano alla PH, è ovvio che le diverse condizioni della PH umana non possono essere perfettamente ricapitolate in un modello animale. I modelli animali disponibili possono essere classificati in i) modelli a colpo singolo, ii) a due colpi, iii) knockout e iv) sovraespressioni3. Nei modelli a singolo colpo, la PH è indotta da un singolo stimolo patologico, mentre i modelli a due colpi combinano due stimoli patologici con l’obiettivo di indurre LA PH più grave e quindi di imitare più da vicino la complessa malattia umana. Oltre alle differenze eziologiche, i diversi stimoli si trasfono differenze di modellazione PH che dipendono anche dalla specie e dal background genetico degli animali4.
Uno dei modelli di roditori PH classici più comunemente utilizzati è il modello di ipossia cronica2. L’ipossia è nota per indurre il PH nell’uomo e in diverse specie animali. L’ipossia ha il vantaggio di essere uno stimolo fisiologico per la PH(tabella 1). Tuttavia, mentre il grado di ipossia utilizzato per indurre PH nei roditori è molto più grave che negli esseri umani, il singolo insulto (ipossia) porta solo ad una lieve forma di rimodellamento vascolare. Questo non imita la gravità della malattia umana. L’aggiunta di un secondo colpo, uno stimolo in più per indurre PH, ha mostrato risultati promettenti: l’iniezione del composto SU5416 ai roditori combinato con lo stimolo ipossico induce un fenotipo PHpiù grave 2,5,6. SU5416 è un inibitore del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) recettore-2. Blocca i recettori VEGF e porta all’apoptosi cellulare endoteliale. In condizioni ipossiche, questo stimola la proliferazione di un sottoinsieme di cellule endoteliali resistenti all’apoptosi. Inoltre, SU5416 porta alla proliferazione delle cellule muscolari lisce. La combinazione di questi effetti si traduce in rimodellamento vascolare patologico della circolazione polmonare e porta ad elevata pressione PA e rimodellamento ventricolaredestro 2,5,7. Il modello è stato descritto per la prima volta neiratti 6 e successivamente applicato aitopi 4,5,7. Il modello murino presenta rimodellamenti vascolari meno gravi rispetto ai ratti. Inoltre, quando è tornato alla normasa, il PH continua a progredire nei ratti, mentre nei topi è parzialmente reversibile.
Il protocollo seguente descrive tutti i passaggi per la modellazione di PH nei topi utilizzando il metodo Hypoxia/SU5416 (pianificazione, sequenza temporale, esecuzione). Inoltre, la caratterizzazione del modello è descritta in questo protocollo: funzionalmente (misurando in modo invasivo la pressione ventricolare destra (RV) utilizzando la tecnica del torace aperto), morfometricamente (sezionando e pesando sia il ventricolo destro che quello sinistro), così come istologicamente (valutando il rimodellamento vascolare polmonare, l’ipertrofia e fibrosi cardiomiocite destra ventricolari).
Tutti i passaggi e i metodi descritti in questo protocollo possono essere facilmente implementati dagli investigatori a qualsiasi livello di esperienza. Mentre le misurazioni funzionali del camper utilizzando la tecnica del torace aperto (descritto qui) non sono il metodo gold standard sul campo, ha il vantaggio che può essere appreso rapidamente e riprodotto con precisione anche da uno sperimentatore meno esperto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive come modellare la PH nei topi combinando due stimoli patologici: ipossia cronica e iniezione su5416 (Ipossia/SU5416)18. Nel tentativo di correlare questo modello di topo con la condizione di PH umana, si deve inevitabilmente guardare alla classificazione PH corrente, illustrata nella tabella 1. PH in quasi tutte le forme è caratterizzato da vasoconstriction polmonare e proliferazione aberrante di cellule muscolari endoteliali e lisce. Questo porta ad un…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell’American Heart Association (AHA- 17SDG33370112 e 18IPA34170258) e dal National Institutes of Health NIH K01 HL135474 a Y.S. O.B è stato sostenuto dalla Deutsche Herzstiftung.
Materials
| Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
| Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
| Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Connection tubing and valves | |||
| Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
| Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
| Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
| Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Dry ice | |||
| Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
| Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
| Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
| Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
| Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
| Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
| Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
| Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
| Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
| Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
| Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
| Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
| Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
| Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
| SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
| Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
| Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
| Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
| Toluol | Roth | 9558.3 | |
| Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
| Xylene | Roth |
References
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