Inducción y caracterización de la hipertensión pulmonar en ratones utilizando el modelo Hypoxia/SU5416

Summary

Este protocolo describe la inducción de hipertensión pulmonar (PH) en ratones en función de la exposición a la hipoxia y la inyección de un antagonista del receptor VEGF. Los animales desarrollan PH e hipertrofia ventricular derecha (RV) 3 semanas después del inicio del protocolo. También se presenta la caracterización funcional y morfométrica del modelo.

Abstract

La hipertensión pulmonar (PH) es una afección fisiopatológica, definida por una presión arterial pulmonar media superior a 25 mm Hg en reposo, según lo evaluado por el cateterismo cardíaco derecho. Un amplio espectro de enfermedades puede conducir a PH, diferenciándose en su etiología, histopatología, presentación clínica, pronóstico y respuesta al tratamiento. A pesar de los avances significativos en los últimos años, la PH sigue siendo una enfermedad no curada. Comprender los mecanismos subyacentes puede allanar el camino para el desarrollo de nuevas terapias. Los modelos animales son importantes herramientas de investigación para lograr este objetivo. Actualmente, hay varios modelos disponibles para recapitular PH. Este protocolo describe un modelo PH de ratón de dos golpes. Los estímulos para el desarrollo de PH son la hipoxia y la inyección de SU5416, un antagonista del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Tres semanas después del inicio de la hipoxia/SU5416, los animales desarrollan remodelación vascular pulmonar imitando los cambios histopatológicos observados en el PH humano (predominantemente el Grupo 1). La remodelación vascular en la circulación pulmonar da como resultado la remodelación del ventrículo derecho (RV). Se describen en detalle los procedimientos para medir las presiones RV (utilizando el método torácico abierto), los análisis morfométricos de la RV (mediante la disección y el pesaje de ambos ventrículos cardíacos) y las evaluaciones histológicas de la remodelación (tanto pulmonar mediante la evaluación de la remodelación vascular como el cardíaco mediante la evaluación de la hipertrofia y la fibrosis de cardiomiocito RV). Las ventajas de este protocolo son la posibilidad de la aplicación tanto en ratones de tipo salvaje como en ratones genéticamente modificados, la implementación relativamente fácil y de bajo costo, y el rápido desarrollo de la enfermedad de interés (3 semanas). Las limitaciones de este método son que los ratones no desarrollan un fenotipo grave y el PH es reversible al regresar a la normoxia. La prevención, así como los estudios de terapia, se pueden implementar fácilmente en este modelo, sin la necesidad de habilidades avanzadas (a diferencia de los modelos de roedores quirúrgicos).

Introduction

La hipertensión pulmonar (PH) es una afección fisiopatológica, definida por una presión arterial pulmonar media (PA) superior a 25 mm Hg en reposo, según lo evaluado por el cateterismo cardíaco derecho^1,2. Hay una variedad de enfermedades que pueden conducir a PH. En un intento de organizar las condiciones asociadas al PH, se han desarrollado varios sistemas de clasificación. La clasificación clínica actual clasifica las múltiples enfermedades asociadas al PH en 5 grupos diferentes¹. Esta distinción es de importancia ya que varios grupos de pacientes tienen enfermedades que difieren en su presentación clínica, patología, pronóstico y respuesta al tratamiento^2. La Tabla 1 resume la clasificación actual, complementada con las características histopatológicas básicas de cada enfermedad.

Tabla 1: Resumen de la clasificación clínica de PH, junto con las principales características histopatológicas dentro de los grupos. Adecuación del protocolo Hypoxia/SU5416 para el modelado PH. Esta tabla se ha modificado a partir de¹⁹. PH: Hipertensión pulmonar, HAP: Hipertensión arterial pulmonar

A pesar de los avances significativos en el tratamiento de las enfermedades asociadas al PH, el PH sigue sin cura, con una tasa de mortalidad de 3 años que oscila entre el 20% y el 80%^3. Esto indica la necesidad imperiosa de comprender los mecanismos subyacentes de PH y, a partir de entonces, el desarrollo de nuevas terapias para prevenir, ralentizar la progresión y curar la enfermedad. Los modelos animales son de crucial importancia para este ámbito. Actualmente, existen varios modelos para estudiar PH. El lector interesado se refiere a las excelentes críticas sobre este tema^2,3,4. Teniendo en cuenta la variedad de enfermedades que conducen a PH, es obvio que las diversas condiciones del PH humano no se pueden recapitular perfectamente en un modelo animal. Los modelos animales disponibles se pueden clasificar en i) single-hit, ii) two-hit, iii) knockout, y iv) overexpression modelos³. En los modelos de un solo golpe, ph es inducido por un solo estímulo patológico, mientras que los modelos de dos golpes combinan dos estímulos patológicos con el objetivo de inducir a PH más grave y por lo tanto imitar más estrechamente la compleja enfermedad humana. Además de las diferencias etiológicas, los diversos estímulos dan lugar a diferencias de modelado de PH que dependen también de la especie y el fondo genético de los animales⁴.

Uno de los modelos clásicos de roedores PH más utilizados es la hipoxia crónica modelo^2. La hipoxia es conocida por inducir PH en humanos, así como en varias especies animales. La hipoxia tiene la ventaja de ser un estímulo fisiológico para PH (Tabla 1). Sin embargo, mientras que el grado de hipoxia utilizado para inducir PH en roedores es mucho más grave que en los seres humanos, el único insulto (hipoxia) conduce sólo a una forma leve de remodelación vascular. Esto no imita la gravedad de la enfermedad humana. La adición de un segundo golpe, un estímulo adicional para inducir PH, mostró resultados prometedores: la inyección del compuesto SU5416 a los roedores combinados con el estímulo hipoxico induce un fenotipo PH más grave^2,5,6. SU5416 es un inhibidor del receptor-2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Bloquea los receptores VEGF y conduce a la apoptosis celular endotelial. En condiciones hipoxicas, esto estimula la proliferación de un subconjunto de células endoteliales resistentes a la apoptosis. Además, SU5416 conduce a la proliferación de células musculares lisas. La combinación de estos efectos da como resultado una remodelación vascular patológica de la circulación pulmonar y conduce a una presión patológica elevada y una remodelación ventricular derecha^2,,5,,7. El modelo fue descrito por primera vez en ratas⁶ y más tarde aplicado a ratones^4,,5,,7. El modelo de ratón presenta una remodelación vascular menos grave en comparación con las ratas. Además, cuando se vuelve a la normoxia, PH continúa progresando en ratas, mientras que en ratones es parcialmente reversible.

El protocolo siguiente describe todos los pasos para modelar PH en ratones mediante el método Hypoxia/SU5416 (planificación, cronología, ejecución). Además, la caracterización del modelo se describe en este protocolo: funcionalmente (midiendo invasivamente la presión ventricular derecha (RV) utilizando la técnica del pecho abierto), morfométricamente (diseccionando y pesando tanto los ventrículos derecho e izquierdo), como histológicamente (mediante la evaluación de la remodelación vascular pulmonar, la hipertrofia cardiomiomiocítica ventricular derecha y la fibrosis).

Todos los pasos y métodos descritos en este protocolo pueden ser fácilmente implementados por los investigadores en cualquier nivel de experiencia. Si bien las mediciones funcionales de la RV utilizando la técnica de pecho abierto (descrita aquí) no es el método estándar de oro en el campo, tiene la ventaja de que se puede aprender rápidamente y reproducir con precisión incluso por un experimentador menos experimentado.

Protocol

Antes de cualquier experimentación animal obtener la autorización del comité institucional de cuidado de animales local. Los experimentos actuales se llevaron a cabo después de la aprobación por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí. 1. Inducción de PH Preparación Antes de comenzar el estudio, planifique cuidadosamente el diseño experimental. Asegúrese de que los ratones estén sometidos a hipox…

Representative Results

En este protocolo, se describe en detalle la creación del modelo Hypoxia/SU5416 para inducir PH en ratones. Además, detallamos todos los pasos necesarios para realizar una evaluación vascular y cardíaca pulmonar al final del período de observación. En la Figura 1A 13,1414se muestra una visión general del diseño experimental de este modelo. Los ratones son sometidos a hipoxia normob…

Discussion

Este protocolo describe cómo modelar PH en ratones combinando dos estímulos patológicos: hipoxia crónica e inyección SU5416 (Hypoxia/SU5416)¹⁸. En un intento de correlacionar este modelo de ratón con la condición PH humana, inevitablemente se debe mirar la clasificación PH actual, que se muestra en el Cuadro 1. PH en casi todas las formas se caracteriza por vasoconstricción pulmonar y proliferación aberrante de células musculares endoteliales y lisas. Esto conduce a una…

Materials

Acetic acid glacial	Roth	3738.1
Acetone, Histology Grade	The Lab Depot	VT110D
ADVantage Pressure-Volume System	Transonic	ADV500
Bouin's solution	Sigma	Ht10132
Cautery System	Fine Science Tools	18000-00
Connection tubing and valves
Cotton-Tipped Applicators	Covidien	8884541300
Coverslips, 24 x50 mm	Roth	1871
Data Acquisition and Analysis	Emka	iox2
Direct Red 80	Sigma	365548-5G
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Sigma Aldrich	276855
Dry ice
Dumont # 5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont # 7 Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20
Embedding molds	Sigma Aldrich	E-6032
Eosin Solution Aqueous	Sigma	HT110216
Ethanol, laboratory Grade	Carolina Biological Supply Company	861285
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Goat Serum	invitrogen	16210-064
Heating pad	Gaymar	T/Pump
Hematoxylin 2	Thermo Scientific	7231
Hypoxic chamber	Biospherix	A30274P
Induction chamber	DRE Veterinary	12570
Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") )	Terumo	SR*FF2025
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-40
Isoflurane vaporizer	DRE Veterinary	12432
Mice (C57BL/6)	Charles River
Needles 25 G x 5/8"	BD	305122
OCT	Tissue Tek	4583
PBS (Phosphate Buffered Saline)	Corning	21-031-CV
Piric Acid- Saturated Solution 1.3 %	Sigma	P6744-1GA
Pressure volume catheter	Transonic	FTH-1212B-4018
Retractor	Kent Scientific	SURGI-5001
Static oxygen Controller ProOx 360	Biospherix	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
Surgical Suture, black braided silk, 5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
Surgical tape	3M	1527-1
Syringe 10 ml	BD	303134
Syringes with needle 1 ml	BD	309626
Sytox Green Nuclein Acid Stain	Thermo Scientific	S7020
Tenotomy scissors	Pricon	60-521
Toluol	Roth	9558.3
Ventilator	CWE	SAR-830/P
WGA Alexa Fluor	Thermo Scientific	W11261
Xylene	Roth