Protocollo di isolamento gocciolina del lipido rapida utilizzando un Kit di isolamento organello ben consolidate
Summary
Questo protocollo stabilisce un metodo novello di isolamento della gocciolina del lipido e la purificazione dai fegati del topo, utilizzando un kit di isolamento ben consolidata del reticolo endoplasmatico.
Abstract
Le goccioline del lipido (LDs) sono organelli bioattivi trovati all’interno del citosol delle più eucariotiche e alcune cellule procariotiche. LDs sono composte di lipidi neutri, racchiusi da un monostrato di fosfolipidi e proteine. Lipidi epatici di LD, come ceramidi e proteine sono implicati in diverse patologie che causano steatosi epatica. Anche se i metodi precedenti sono stati stabiliti per l’isolamento di LD, richiedono una lunga preparazione dei reagenti e non sono progettati per l’isolamento di più compartimenti subcellulari. Abbiamo cercato di stabilire un nuovo protocollo per consentire l’isolamento di LDs, reticolo endoplasmico (ER) e lisosomi da un fegato del mouse.
Ulteriormente, tutti i reagenti utilizzati nel protocollo presentato qui sono commercialmente disponibili e richiedono una preparazione minima reagente senza sacrificare la purezza di LD. Qui presentiamo i dati che confrontano questo nuovo protocollo per un protocollo di gradiente di saccarosio standard, dimostrando la resa, la morfologia e la purezza paragonabile. Inoltre, possiamo isolare ER e lisosomi utilizzando lo stesso esempio, fornendo informazioni dettagliate sulla formazione e flusso intracellulare di lipidi e le proteine associate.
Introduction
LDs sono organelli bioattivi trovati nel citosol delle cellule eucariotiche più e alcune cellule procariotiche1,2,3. Il nucleo di LD è composto da lipidi neutri come esteri del colesterolo e del trigliceride (TG). Inoltre contengono ceramidi, lipidi bioattivi coinvolti nella segnalazione cellulare vie4,5. LDs sono circondati da un monostrato di fosfolipidi e rivestito con proteine, tra cui la perilipina proteine perilipina 2 (PLIN2) e 3 (PLIN3)1,5,6. Sono presenti anche enzimi lipogenic, lipasi e proteine traffico di membrana che sono state collegate a parecchie malattie steatotic epatiche, tra cui la steatosi epatica, epatopatia alcolica e l’epatite C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs sono pensati per formare dalla membrana esterna dell’ER e contengono recentemente sintetizzato TG provenienti da ER-derivati di acidi grassi liberi11. Tuttavia, rimane sconosciuto se i lipidi in pool bud, rimanere connessi, o sono asportati dal ER6,11, rendendo l’isolamento di LDs esente da ER tecnicamente impegnativi. Gli acidi grassi liberi possono essere liberati da LDs dall’azione delle lipasi superficie per fornire per la produzione di energia o sintesi della membrana. Inoltre, LDs può essere degradata tramite lipophagy come un meccanismo di regolamentazione e di produrre acidi grassi liberi12.
Oltre alla ER e lisosomi, ci sono altri organelli — come i mitocondri, gli endosomi, peroxisomes e membrana plasmatica — che si trovano all’interno di stretta associazione di LDs11. Questa stretta poligamia rende difficile effettuare un’estrazione di LD pura. Tuttavia, densità bassa innata dei lipidi neutri può essere sfruttato tramite centrifugazione5.
Tradizionalmente, LDs sono state isolate utilizzando un saccarosio densità gradiente1,5,13. Tuttavia, questi metodi non sono stati progettati per isolare altri organelli. Inoltre, essi richiedono la preparazione che richiede tempo di reagenti. Questo protocollo si adatta un isolamento di ER disponibile in commercio kit (vedere la Tabella materiali) per consentire l’isolamento di LD. Usiamo il tampone di estrazione fornito dal kit, aggiunta di un passaggio di isolamento di LD. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato anche per ER e lysosomal isolamento utilizzando gli stessi campioni, permettendo per un’immagine più completa del ciclo di vita di LDs. Per convalidare questo nuovo metodo, analisi di rendimento LD, morfologia, dimensioni e purezza. Confrontiamo i risultati presentati qui a quelli ottenuti con un protocollo ampiamente utilizzato utilizzando un gradiente di saccarosio per l’isolamento di LD.
Abbiamo usato un 10 a 12-week-old, mouse C57BL/6 femminile 20g digiunato per 16 h (rimozione di cibo alle 17 per un periodo di isolamento di 9 LD) con libero accesso all’acqua. La resa tipica per TG è di 0,6 mg/g di fegato, e per la proteina di LD, è 0,25 mg/g di fegato. Questo fornisce abbastanza materiale per ~ 10 immunoblots di SDS PAGE. Il protocollo sotto i dettagli dei reagenti utilizzati e un protocollo adatto per un singolo 1 g di fegato. Il protocollo di isolamento gradiente di saccarosio è adattato da Sato14 e Wu15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biologia di LD epatica sempre più sta riconoscenda come regolatore critico della fisiologia epatocellulare in salute e malattia. Come buona fede organelli, LDs sono dinamici, interagire con altre strutture cellulari e contengono all’interno dei loro componenti bioattivi coinvolti nell’omeostasi del glucosio e del lipido. Il gradiente di saccarosio è usato ordinariamente per l’isolamento di LD e consente ai ricercatori di studiare la struttura della LD, ma richiede loro di fare numerosi buffer. Abbiamo dimostrato che l’…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la famiglia Abramson Cancer Research Institute. Questo lavoro è supportato dalle seguenti concessioni: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medica facoltà Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (r.m.c.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Questo lavoro è stato sostenuto in parte da NIH P30-DK050306 e suoi servizi di nucleo (patologia molecolare e di Imaging, biologia molecolare/Gene Expression Core e cella cultura Core) e il suo pilota programma di sussidi. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
References
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