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Biology

Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59290
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll stellt eine neuartige Methode der Lipid Droplet Isolation und Reinigung von Maus Lebern, mit einem etablierten endoplasmatische Retikulum Isolierung-Kit.

Abstract

Lipid-Tröpfchen (LDs) sind bioaktive Organellen innerhalb der Zellflüssigkeit der meisten eukaryotischen und einige prokaryotischen Zellen gefunden. Kirche Jesu Christi bestehen aus neutralen Lipiden, umhüllt von einer Monoschicht von Phospholipiden und Proteinen. Hepatische LD Lipide, wie Ceramide und Proteine sind in mehrere Krankheiten verwickelt, die hepatische Steatose verursachen. Obwohl die bisherige Methoden für LD isoliert aufgestellt wurden, sie erfordern eine aufwändige Vorbereitung der Reagenzien und eignen sich nicht für die Isolierung von mehreren subzelluläre Kompartimente. Wir wollten ein neues Protokoll zu ermöglichen, die Isolation der LDs, endoplasmatische Retikulum (ER) und Lysosomen aus einem einzigen Mausklick Leber zu etablieren.

Weitere, alle Reagenzien im hier vorgestellten Protokoll sind im Handel erhältlich und erfordern minimale Reagenz Vorbereitung ohne Einbußen bei der LD Reinheit. Hier stellen wir Vergleiche dieses neue Protokoll zu einem standard Saccharose-gradient-Protokoll zeigen vergleichbare Reinheit, Morphologie und Ertrag. Darüber hinaus können wir ER Lysosomen mit der gleichen Probe isolieren und detaillierte Einblicke in die Entstehung und intrazellulären Flux von Lipiden und ihre assoziierten Proteinen.

Introduction

Kirche Jesu Christi sind bioaktive Organellen in der Zellflüssigkeit der meisten eukaryotischen Zellen und einige prokaryotische Zellen1,2,3gefunden. Der LD-Kern besteht aus neutralen Lipiden wie Triglyceride (TG) und Cholesterin-Ester. Sie enthalten auch Ceramide, bioaktiver Lipide zellulären Signal-Wege4,5beteiligt. LDs sind umgeben von einem Phospholipid Monolage und beschichtet mit Proteinen, einschließlich der Perilipin Proteine Perilipin 2 (PLIN2) und 3 (PLIN3)1,5,6. Anwesend sind auch Lipogenic Enzyme Lipasen und Menschenhandel Membranproteine, die mehrere hepatischen steatotic Krankheiten, einschließlich Nichtalkoholische Fettleber, alkoholische Leberkrankheit und Hepatitis C3,5 verbunden ,6,7,8,9,10.

Hlt werden gedacht, um von der äußeren Membran von der Notaufnahme bilden und enthalten neugebildete TG von freien Fettsäuren ER abgeleitet11bezogen. Es bleibt jedoch unbekannt, ob die gepoolten Lipide Knospe, verbunden bleiben, oder werden herausgeschnitten, aus der ER6,11, so dass die Isolierung des LDs befreit ER technisch anspruchsvoll. Freie Fettsäuren können durch die Wirkung der Oberfläche Lipasen vorzusehen, Energieerzeugung oder Membran-Synthese von LDs befreit werden. Darüber hinaus können LDs über Lipophagy als Regelmechanismus und freie Fettsäuren12produzieren abgebaut werden.

Neben der ER und Lysosomen, gibt es andere Organellen – z. B. Endosomen, Mitochondrien, Peroxisomen und die Plasmamembran – in enger Zusammenarbeit von LDs11enthalten sind. Diese engen Polygamie macht es schwierig, eine reine LD-Extraktion durchführen. Jedoch kann neutrale Lipide angeborenen geringer Dichte durch Zentrifugation5genutzt werden.

Traditionell wurden LDs isoliert mit einer Saccharose Dichte Gradienten1,5,13. Jedoch wurden diese Methoden nicht so andere Organellen zu isolieren. Darüber hinaus benötigen sie die zeitraubende Vorbereitung der Reagenzien. Dieses Protokoll passt eine handelsübliche ER Isolation kit (siehe die Tabelle der Materialien), um LD Isolierung zu ermöglichen. Wir verwenden die Extraktionspuffer zur Verfügung gestellt durch das Kit einen LD Isolierung Schritt hinzugefügt. Darüber hinaus kann das Protokoll auch für ER und lysosomale Isolation unter Verwendung der gleichen Proben, damit ein umfassenderes Bild des Lebenszyklus von LDs verwendet werden. Um diese neue Methode zu überprüfen, überprüfen wir LD Ertrag, Morphologie, Größe und Reinheit. Wir vergleichen die Ergebnisse, die hier zu denen, die mit einem weit verbreiteten Protokoll unter Verwendung einer Saccharose Steigung für LD-Isolierung.

Wir verwendeten eine 10 bis 12-Wochen alten, 20 g weiblichen C57BL/6 Maus fastete für 16 h (Essen Entfernung um 17:00 09:00 LD Isolierung Zeit) mit freiem Zugang zu Wasser. Die typische Ausbeute für TG beträgt 0,6 mg/g Leber, und es ist für LD Protein, 0,25 mg/g Leber. Dies bietet genügend Material für ~ 10 Immunoblots von SDS-PAGE. Das Protokoll unten Details der verwendeten Reagenzien und ein Protokoll für eine einzelne 1 g Leber geeignet. Die Saccharose gradient Isolierung Protokoll ist Sato14 und Wu15angepasst.

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Protocol

Alle Experimente wurden auf einem Labortisch mit persönlicher Schutzausrüstung geeignet für Biosafety Niveau 1, einschließlich einen Kittel, Handschuhe und Schutzbrille. Versuche wurden nach der Genehmigung durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Pennsylvania Protokollen durchgeführt. Wurden alle Anstrengungen unternommen, um tierische Beschwerden zu minimieren, und die Tiere wurden humane pfleglich behandelt.

(1) LD-Isolierung mit einer ER-Isolierungskit

  1. Vorbereitung
    Hinweis: Die aufgeführten Beträge eignen sich für eine einzelne 1 g-Maus-Leber.
    1. Bereiten Sie 10 mL 1 X isotonische Extraktionspuffer (IE Puffer, aus dem ER Isolierungskit vor) durch Verdünnung 2 mL 5 X IE Puffer mit 8 mL Reinstwasser. Kühlen Sie den Puffer ab, indem es auf Eis.
    2. Bereiten Sie 100 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS vor) durch Verdünnung 10 mL 10 X PBS in 90 mL Reinstwasser. Indem es auf Eis abkühlen.
    3. 10 mL 5 %-Polyethylenglykol- p--(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-Phenyl-Äther (PGPE) durch Verdünnung 500 µL PGPE in 9,5 mL Reinstwasser vorbereiten. Verwenden Sie eine 1 mL Spritze, um PGPE zu messen, wie es dickflüssig ist. Indem es auf Eis abkühlen.
    4. Cool alle Röhren auf Eis gelegt: 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 15 mL Zentrifuge Rohre, 50 mL High-Speed-Zentrifuge Röhren und 13 mL Ultrazentrifugen Röhren.
    5. Cool alle benötigten Zentrifugen auf 4 ° C: ein Microcentrifuge eine Hochleistungs-Zentrifuge für 15 mL Tuben, eine High-Speed-Zentrifuge für 50 mL Röhrchen und einer Ultrazentrifuge.
    6. Zange und Dissektion Schere durch Autoklavieren zu sterilisieren.
  2. Gewebe-Vorbereitung
    1. Einschläfern der Maus, indem man sie in eine Kammer gefüllt mit 100 % CO2 für 10 min. bestätigen Euthanasie durch zervikale Dislokation durchführen.
    2. Verwendung von sterilen Pinzette und Dissektion Schere, schneiden Sie die Haut und Muskel Schichten des Bauches auf der vorderen/hinteren Achse, die Leber verfügbar zu machen.
    3. Schneiden Sie die Bänder verbinden die Leber mit dem Zwerchfell und Darm. Verwenden Sie Zange um den Darm Weg von der Leber, in Richtung der hinteren Bänder verfügbar machen zu ziehen.
    4. Zwischen der Leber und der dorsalen Rippen geschnitten, ist befreit von anterior Posterior bewegen, bis die Leber.
    5. Übertragen Sie die Leber auf einem kalten 5 cm Petrischale mit 10 mL kalten 1 X PBS.
    6. Waschen Sie die Leber 2 X auf einer rockigen Plattform in 10 mL kalten 1 X PBS für 5 min bei 4 ° C in den 5 cm Petrischale. 1 X PBS nach dem letzten Waschen abgießen.
    7. Eine Größe-10 sterile chirurgische Messer verwenden (siehe Tabelle der Materialien), um die Leber in 3 – 5 mm Stücke in den 5 cm Petrischale (Abbildung 1A) Würfeln.
    8. Waschen Sie die gewürfelte Leber 2 X mit 10 mL kalten 1 X PBS für 5 min bei 4 ° C in den 5 cm Petrischale.
      Hinweis: Für Lysosomen Isolierung, 0,5 g Leber auf eine saubere 45 mL Homogenisator übertragen und folgen Sie den Anweisungen geliefert durch den Lysosomen Extraktion kit (siehe die Tabelle der Materialien).
    9. Dekantieren Sie 1 X PBS und übertragen Sie die gewürfelte Leber Stücke auf der kalten 45 mL Dounce-Homogenisator. Stellen Sie sicher, dass alle Teile am unteren Rand der Homogenisator gehen.
    10. 7 mL kalten 1 X IE Puffer (aus dem ER Isolierungskit) hinzugeben und auf Eis durch Verschieben der Stößel nach oben und unten 20 X homogenisieren. Sicherstellen Sie, dass der Stößel am unteren Rand der Homogenisator bei jedem Schlag geht.
    11. Übertragen Sie das Homogenat (Abbildung 1 b) auf eine kalte 15 mL Zentrifugenröhrchen.
    12. Spülen Sie den Homogenisator mit 1 mL kalten 1 x IE Puffer (aus dem ER Isolierungskit) und fügen Sie diese mit dem Rest der Homogenat.
  3. LD-Isolierung
    1. Entfernen Sie Kerne durch Zentrifugieren das Homogenat in einer Hochleistungs-Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min bei 4 ° C (Abbildung 1).
    2. Übertragen Sie die postnukleare überstand (PNS) auf eine neue, kalte 50 mL Zentrifugenröhrchen. Um LD Verlust zu vermeiden, sicherstellen Sie, dass Lipid versammelten sich am oberen Rand der 15 mL Tube Nukleinsäuretablette ist, vor der Übertragung der PNS.
    3. Nehmen Sie 100 µL aliquoten der PNS für Reinheitsanalyse und legen Sie sie in einen kalten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch. Legen Sie es beiseite auf Eis.
    4. Entfernen Sie Mitochondrien, Zentrifugieren der PNS Probe, nicht den Aliquoten in einer gekühlten High-Speed-Zentrifuge bei 12.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
      1. Optional: für Rohöl LD (CLD) Isolate (mit Zellflüssigkeit und Zellmembran Kontamination), die obere Lipidschicht mit einer Glaspipette zu sammeln und zu einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen werden. 1.4 Abschnitt weiter.
    5. Übertragen Sie den postmitochondrial überstand (PMS) auf einer Ultrazentrifuge Rohr. Um LD Verlust zu vermeiden, sicherstellen Sie, dass Lipid versammelten sich am oberen Nukleinsäuretablette ist, vor der Übertragung der PMS.
    6. Nehmen Sie 100 µL aliquoten von PMS für Reinheitsanalyse und legen Sie sie in einen kalten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch. Legen Sie es beiseite auf Eis.
    7. Kälte 1 x IE Puffer gegen das Rohr zusammenbricht während Ultrazentrifugation füllen Sie einer Ultrazentrifuge Rohr bis zum Rand ein.
    8. Balancieren Sie die Proben zu und Zentrifugieren sie in einer Ultrazentrifuge bei 100.000 X g für 60 min bei 4 ° C (Abbildung 1).
    9. Um die LD-Schicht entfernen, kippen Sie das Rohr in einem Winkel von 45° und mit einer Glaspipette Aspirieren. Übertragen Sie das Pellet auf einen kalten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch.
      Hinweis: Die Tablette enthält isolierte ER. Verwenden Sie diese Fraktion flussabwärts ER isoliert.
    10. Sammeln Sie 100 µL des Überstands Post-ER (PER) unter die Lipidschicht für Reinheitsanalyse.
  4. LD-waschen
    1. Die LD-Fraktion gesammelt in einem 1,7 Microcentrifuge Schlauch auf ein Gesamtvolumen von 1,3 mL fügen Sie 1 X PBS hinzu.
    2. Wirbel der Probe.
    3. Zentrifuge in einem Microcentrifuge Höchstgeschwindigkeit für 5 min bei 4 ° C zu jeder Zellenrückstand Pellets. Erwärmen Sie das Rohr sanft mit den Händen zu helfen, die LD-Schicht aufzuwirbeln. Übertragen Sie den Überstand, einschließlich die Lipidschicht, zu einem neuen 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1–1.4.3 2 X, x-3, bis die Kugel nicht mehr sichtbar ist.
    5. Die Pellet-freie LD überstand zu einem Endvolumen von 1,5 mL 1 X PBS hinzufügen. Waschen Sie die Lipid-Anteil durch Zentrifugieren in einem Microcentrifuge Höchstgeschwindigkeit für 5 min bei 4 ° C.
    6. Entfernen Sie 1 mL 1 X PBS (unterhalb der Lipidschicht) mit einer Glaspipette ohne Störung der Lipidschicht.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.5 und 1.4.6 x-5 4-Fach, bis 1 X PBS mit keine Trübung visuell transparent ist.
    8. Entfernen Sie alle 1 X PBS unterhalb der Lipidschicht mit einer Glaspipette (Abb. 1E).
    9. Verwenden Sie das Ergebnis, eine reine LD Bruchteil für nachgelagerte Analyse.
  5. LD Protein Quantifizierung von Bicinchoninic Acid Test
    Hinweis: Verwenden Sie eine Bicinchoninic Säure-Assay (BCA) nicht, wenn LD Morphologie soll beurteilt werden.
    1. Die LD in 500 μl 5 % PGPE aufzuwirbeln.
    2. Kochen Sie die Proben 5 min bei 95 ° C, Wirbel, und inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 5 min abkühlen lassen.
    3. Wiederholen Sie Schritt 1.5.2 eine zusätzliche 2 X.
    4. Beschallen Sie die Proben 5 min mit einem 30 s ein-/aus-Zyklus, bei mittlerer Intensität.
    5. Normalisieren Sie die Proben durch die Messung der Konzentration des Proteins in aller Reinheit Analyse Proben und in der LD-Fraktion von BCA-Assay.

(2) LD-Isolierung mit Saccharose Dichtegradient

  1. Vorbereitung
    1. 200 mL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 1 mM EDTA [pH 8.0]) zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.
    2. Machen Sie 100 mL 60 % (w/V) Saccharoselösung in TE-Puffer durch Auflösen von 60 g Saccharose in TE-Puffer, bringen das Endvolumen bis 100 mL. Indem es auf Eis abkühlen.
    3. 6 mL Zuckerlösung 40 % (w/V) durch Zugabe von 4 mL 60 % Saccharose, 2 mL TE-Puffer zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.
    4. 6 mL Zuckerlösung 25 % (w/V) durch Zugabe von 2,5 mL 60 % Saccharose zu 3,5 mL TE-Puffer zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.
    5. 4 mL 10 % (w/V) Saccharose-Lösung durch Zugabe von 60 % Saccharose 0,7 mL bis 3,3 mL von TE-Puffer zu machen. Indem es auf Eis abkühlen.
    6. Machen Sie 10 mL Protease und Phosphatase-Inhibitor-Lösung, indem Sie eine Tablette von Protease und Phosphatase-Inhibitoren, 10 mL von TE-Puffer.
    7. Bereiten Sie Gewebe Homogenat Puffer, indem Sie 50 mL 60 % Saccharose Stammlösung 4 mL Protease und Phosphatase-Inhibitor-Lösung hinzufügen. Indem es auf Eis abkühlen.
    8. Bereiten Sie Overlay Puffer durch Zugabe von 2 mL der Protease und Phosphatase-Inhibitor-Lösung, 50 mL von TE-Puffer. Indem es auf Eis abkühlen.
    9. Bereiten Sie 100 mL 1 X PBS verdünnen 10 mL 10 X PBS in 90 mL Reinstwasser vor. Indem es auf Eis abkühlen.
    10. Vorbereitung 10 mL 5 % PGPE durch Verdünnung 500 µL PGPE in 9,5 mL Reinstwasser. Verwenden Sie eine 1 mL Spritze, um PGPE zu messen, wie es dickflüssig ist. Indem es auf Eis abkühlen.
    11. Die folgenden Zentrifuge Rohre, indem sie auf Eis abkühlen: 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen, 15 mL Zentrifuge Rohre, 50 mL High-Speed-Zentrifuge Röhren und 13 mL Ultrazentrifugen Röhren.
    12. Cool die benötigten Zentrifugen auf 4 ° C: a Microcentrifuge, eine Hochleistungs-Zentrifuge (für 15 mL Röhrchen), eine High-Speed-Zentrifuge (für 50 mL Röhrchen) und einer Ultrazentrifuge.
  2. Gewebe-Vorbereitung
    1. Verwenden Sie Schritte 1.2.1–1.2.9 zur Homogenisierung des Gewebes Vorbereitung.
    2. 7 mL kalte Gewebe Homogenat Puffer hinzugeben und durch Verschieben der Stößel nach oben und unten 20 X auf dem Eis zu homogenisieren. Während die ersten fünf Striche sicherzustellen Sie, dass die Stößel am unteren Rand der Homogenisator geht.
    3. Übertragen Sie das Homogenat auf eine kalte 15 mL Zentrifugenröhrchen.
    4. Spülen Sie den Homogenisator mit 1 mL kalte Gewebe Homogenat Puffer und überträgt es auf die bisher verwendeten 15 mL Zentrifugenröhrchen.
    5. Bringen Sie das Volumen der Homogenat bis zu 10 mL mit Gewebe Homogenat Puffer.
    6. Zentrifugieren Sie die Probe in einer Hochleistungs-Zentrifuge bei 1.000 X g für 10 min bei 4 ° C.
    7. Übertragen Sie 8 mL Überstand auf eine 50 mL Zentrifugenröhrchen.
    8. Übertragen Sie 100 µL der restlichen Überstand als PNS Probe zur Reinheitsanalyse.
  3. Saccharose Farbverlauf
    1. Kippen Sie die 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 8 mL PNS in einem Winkel von 45°. Hinzugeben Sie 6 mL 40 % Saccharoselösung, sicherzustellen, dass die beiden Phasen getrennt bleiben vorsichtig.
    2. Fügen Sie in ähnlicher Weise langsam 6 mL 25 % Saccharose-Lösung hinzu; Fügen Sie 4 mL 10 % Saccharose-Lösung; Schließlich fügen Sie 8 mL Overlay-Puffer.
    3. Zentrifugieren Sie die Probe in einer High-Speed-Zentrifuge bei 30.000 X g bei 4 ° C für 30 min.
    4. Übertragen Sie die oberste Schicht mit der Kirche Jesu Christi zu einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch.
    5. Führen Sie für LD waschen die Schritte in Abschnitt 1.4.

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Representative Results

Wir haben die LD-Isolierung mit dem ER Kit auf ca. 30 Mäusen durchgeführt und verglichen die Ergebnisse mit denen nach der Saccharose-Isolierung-Protokolls auf ca. 40 Mäuse. Die berichteten Ergebnisse sind typisch für beide Protokolle. Mäusen wurden über Nacht mit freiem Zugang zu Wasser, zu den LD-Ertrag steigern gefastet. LD-Isolierung mit einem Farbverlauf von Saccharose lief parallel mit dem ER Kit LD Isolierung Protokoll. Proben von PNS, PMS, v., Markierungen und LDs während ER Kit LD Isolierung Protokoll gesammelt wurden. Wegen Workflow Einschränkung des Saccharose-Isolierung-Protokolls wurden nur die PNS und LD Isolat gesammelt.

Fluoreszenz-Mikroskopie 50 µL der isolierten LDs waren gemischt mit ein gleiches Volumen von 100 µM 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI). Proben wurden vor Licht geschützt und bei Zimmertemperatur 30 Minuten inkubiert. Die Proben wurden durch Zugabe von 1 mL 1 X PBS, gefolgt durch Zentrifugation und Entfernung von überschüssigen Puffer gewaschen. Der LD-Fraktion stellte 1 µL auf einen Objektträger und vorhanden. Repräsentative 20 x fluoreszierende und Hellfeld LD Bilder entnommen wurden die ER Set LD Isolation und die Saccharose LD-Isolierung (Abbildung 2A-D) Methoden, mit einer invertierten Forschungsmikroskop (siehe die Tabelle der Materialien). Die Hellfeld-Bilder zeigen ähnliches Niveau von Feinstaub, schlägt ähnliche Reinheiten mit unterschiedlichen Protokollen.

Um Unterschiede in der Rendite zwischen den beiden Protokollen zu bestimmen, verwendet wir vergleichbarer Größe Mäuse und Maus Lebern (Abbildung 2EF). Folgende Reinigung, LD TG und Protein-Ebene wurden mit kolorimetrischen Assays (siehe die Tabelle der Materialien) gemessen und die Daten wurden zur Leber Gewicht (Abbildung 2H) normalisiert. Wir fanden, wenn wir das Ausgangsmaterial, normalisiert, dass das LD-Protein und TG nach LD-Isolierung, mit dem ER Kit und Saccharose ähnelten. Um festzustellen, wenn die LD-Größe auch ähnlich war, wir quantifiziert LD Durchmessern mit Bildanalyse-Software (siehe die Tabelle der Materialien). Kirche Jesu Christi reichten von 0,27 bis 6,37 µm. Die Häufigkeitsverteilung der LD Durchmesser zeigt, dass ER Set LD Isolation (Abbildung 3A) und Saccharose LD Isolierung (Abb. 3 b) LDs ähnlicher Größe ergeben.

LD Reinheit zu bewerten, wurden die Proben durch Immunoblotting analysiert. Von SDS-PAGE wurde ein Betrag von 20 µg Protein pro Probe untersucht. Die Proben wurden mit Antikörper-Marker für LDs (PLIN2 und PLIN3), ER (Sec61) (VDAC) Mitochondrien, Lysosomen (LAMP1), Plasmamembran (MEK1), Kerne (Histon H3) und Zytosol (GAPDH) (Abb. 4A) geprüft. PLIN2 in allen Proben außer das ER Kit LD Isolierung erkannt wurde v. und die Saccharose PNS. Die LDs abgeleitet, aus dem ER Kit LD Isolierung und die Saccharose gradient Protokoll beide hatten gleich Reinheit. Keine Bands erschien ER (Sec61), Mitochondrien (VDAC1), Lysosomen (LAMP1), Plasmamembran (Mek1) oder Zytosol (GAPDH). Die CLD hatte Plasmamembran und Zytosol Kontamination aber keine offensichtliche Verunreinigungen vom ER, Mitochondrien, Lysosomen oder. Die Intensität der PLIN2 Band im angepasst ER Protokoll zeigt an, dass ER Protokoll in der LD-Fraktion gegenüber der PNS hatte, während die Saccharose-Protokoll einen Sechsfach höhere PLIN2 Ausdruck in der LD Bruchteil hatte (ca. 14-fold höheren PLIN2 Ausdruck (Daten nicht gezeigt).

Da dieses Protokoll auch die Möglichkeit zur Reinigung von ER und Lysosomen hat, führten wir auch westliche Beflecken um die Reinheit dieser Organellen zu beurteilen. Abbildung 4 b zeigt, die dass der Immunoblots gereinigten ER aus derselben Probe, mit der ER kit (siehe die Tabelle der Materialien) waren frei von PLIN2 sondern hatten bedeutende Niveaus des Proteins ER Sec61A. Die lysosomalen Anreicherung mit kit (siehe die Tabelle der Materialien), Lysosomen waren weiter isoliert und Immunoblotted für LD (PLIN2), ER (Sec61A) und Lysosomen (LAMP1) Marker (Abbildung 4). Zusammen, diese Daten zeigen, dass das Protokoll hier, in Kombination mit handelsüblichen Lysosomen Reinigung Kits vorgestellt, für die reine Isolierung der Leber LDs, ER und Lysosomen von einem einzigen Tier erlauben.

Figure 1
Abbildung 1: Referenz-Bilder, die während der LD-Isolierung mit einer ER-Isolierungskit . (A) gewürfelt 5 mm Leber Stücke in ein 5 cm Petrischale. (B) Leber Homogenat nach Homogenisierung in einem Dounce-Homogenisator. (C) Leber Homogenat nach Zentrifugation bei 1.000 X g; Beachten Sie die leichten Lipidschicht oben, die PNS und das Pellet, Zellenrückstand und nukleare Bruchteil enthalten. (D) LD Schicht nach Ultrazentrifugation bei 100.000 X g; Beachten Sie die prominenten Lipidschicht oben, das KGV und die ER-Fraktion auf der Unterseite. (E) Washed LD Bruch vor der endgültigen Beseitigung des öffentlich-rechtlichen Rundfunks. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schliffbild und Quantitative Analyse vergleicht die LD-Fraktion isoliert mit einer ER-Kit und die LD-Fraktion isoliert mit Saccharose. Vertreter 20 x fluoreszierende Schliffbild von (A) einen DPBDI-gefärbten LD Bruchteil isoliert mit einer ER-Kit und (B) LDs isoliert mit Saccharose. (C) Hellfeld Schliffbild der LD-Fraktion mit einer ER-Kit und (D) die LD-Fraktion isoliert mit Saccharose isoliert. Die Maßstabsleiste = 20 µm. (E) Maus Gewicht und (F) Leber Gewicht. (G) TG-Ausbeute aus gereinigtem LDs auf Leber Gewicht normalisiert. (H) Protein Ausbeute aus gereinigtem LDs auf Leber Gewicht normalisiert. Die Daten sind Mittelwert ± SEM (N = 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Häufigkeitsverteilung der LD Größen. Proben aus vier verschiedenen Mäuse waren befleckt mit DPBDI und Vertreter der 20 X, die Felder quantifiziert wurden. Die Durchmesser wurden mit einer Bildanalyse-Software bewertet. (A) Häufigkeitsverteilung (Bruch) ein LD-Fraktion isoliert mit einer ER-Kit. (B) Häufigkeitsverteilung (Bruch) ein LD-Fraktion isoliert mit Saccharose gradient Dichte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Analyse der LD Reinheit durch Immunoblotting. (A), die angepasste ER Set LD Isolation und das Saccharose Isolierung Protokoll, 20 µg Protein pro Probe zu vergleichen war Immunoblotted. Die folgenden Beispiele wurden geladen: postnukleare überstand (PNS), postmitochondrial überstand (PMS), postendoplasmic Retikulum überstand (PER), rohe LDs (CLD) und LDs (LD). Proben wurden Immunoblotted für LDs (PLIN2 und PLIN3), ER (SEC61A), Mitochondrien (VDAC1), Lysosomen (LAMP1), Zellmembran (MEK1), Kerne (Histon H3) und Zytosol (GAPDH) Markierungen. (B) Reinheitsanalyse eine ER-Fraktion nach weitere Reinigung von der Notaufnahme, mit der ER Set LD Isolation Protokoll (siehe die Tabelle der Materialien). PNS, PMS, ER und LDs wurden geladen und Immunoblotted für LDs (PLIN2) und ER (SEC61A). (C) Reinheitsanalyse der lysosomalen Sekundenbruchteilen nach weitere Reinigung der Lysosomen mit den Lysosomen Bereicherung Kit-Protokoll (siehe die Tabelle der Materialien). PNS und lysosomale Sekundenbruchteilen wurden geladen und Immunoblotted für LDs (PLIN2), ER (SEC61A) und Lysosomen (LAMP1). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Hepatische LD Biologie werden zunehmend als kritische Regulator des hepatozellulären Physiologie in Gesundheit und Krankheit erkannt. Als bona fide Organellen LDs sind dynamisch, interagieren mit anderen Zellstrukturen und enthalten innerhalb Sie bioaktive Komponenten Lipid- und Glukose Homöostase beteiligt. Die Saccharose Steigung wird routinemäßig für LD Isolierung eingesetzt und ermöglicht Ermittler LD Struktur untersuchen, aber es zwingt sie zu zahlreichen Puffer zu machen. Wir haben gezeigt, dass die Verwendung eines handelsüblichen ER isoliert Kit ein weiteres Werkzeug ist, das verwendet werden können nicht nur LD Isolation sondern für Tandem-Isolierung von ER und Lysosomen, zulassend einen umfassenderen Blick auf zelluläre Dynamik als Reaktion auf unterschiedliche experimentellen Bedingungen, ohne signifikante Zunahme der Workflow.

Die Stärke dieses neue Protokoll ist die einfache Setup mit kommerziell oder leicht zugänglich Reagenzien und seine Fähigkeit, gleichzeitig mehrere Organellen zu isolieren. Allerdings gibt es mögliche Nachteile dieser neuen Methode im Auge zu behalten. Mehrere Schritte in diesem Protokoll können die Isolierung der überdimensionalen LDs aus der Leber benachteiligen. Dounce Homogenisierung hat das Potenzial, große LDs durch Scherbeanspruchung zu stören. Eine locker sitzende Dounce Homogenisator Setup kann etwas von dem Druck zu großen LDs. zusätzlich zu lindern, eine 100.000 x g Spin eingesetzt wird, ermöglicht die Trennung von LD und ER. Diese Geschwindigkeit kann auch einen Verlust von großen LDs verursachen, wie ein Bericht 2.000 X g Leber LD Reinigung2empfohlen. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass es verwendet werden kann, um LDs in verschiedenen Größen als kürzlich beschriebenen16zu isolieren. Zusätzlich, obwohl Saccharose Puffer fragile LDs durch den Einsatz von sanften Homogenisierung2bewahren können, ergibt reine LDs mit ähnliche Morphologie und Größenverteilung wie Saccharose gradient Isolierung abgeleitet Homogenisieren mit 1 X IE Puffer . Weitere Studie wird benötigt, um festzustellen, ob die biologische Aktivität durch den Einsatz von PBS-Puffer, die weniger sanft betroffen ist als isotonische Puffer2gebräuchlich ist. Aufgrund dieser möglichen Einschränkungen, es ist wichtig während der ersten zwei Zentrifuge Schritte vollständig die Lipid gesammelt an die Spitze vor der Übertragung überstand Aufschwemmen und empirisch bestimmen die Wirkung der Schlaganfall-Reihe auf den LD-Ertrag für verschiedene Gewebe. Das hier vorgestellte Leber-Protokoll verwendet 20 Schlägen, nachgeben eine vergleichbare Größenverteilung zu anderen veröffentlichten Werk2.

LD-Isolierung mit dem endoplasmatischen Retikulum Isolierungskit liefert Roh und pur-LD-Isolate. CLD Isolate Zellmembran und Zytosol Komponenten enthalten aber ausreichend für einige Anwendungen, wie die Auswertung der LD Morphologie mit Mikroskopie erweisen. Das reine LD-Isolat, fehlt wie durch PLIN2 Ausdruck, bestimmt ER, Mitochondrien, lysosomale, Zellmembran oder Zytosol Kontamination. In der Tat bereichert das reine Isolat aus dem ER Kit LD Isolierung Protokoll PLIN2 mehr als zweifach mit der Saccharose LD Isolationsmethode verglichen. Dieser Unterschied war unerwartet, aufgrund der Ähnlichkeit in Protein und TG ergeben, kann jedoch durch den Einsatz von PBS als Wiederfreisetzung Puffer im Gegensatz zu Saccharose oder isotonische Puffer.

LD-Isolation nach traditionellen Methoden kann auch vor Verschmutzung der LD-Fraktion durch die Plasmamembran2leiden. Obwohl diese Co Isolierung häufig in alle LD-Isolationsmethoden ist und im Verstand gehalten werden, sollte wenn Analyse LD Isolate2, die hier vorgestellten Daten zeigen, dass weitere Ultrazentrifugation des Isolats CLD befreit die Stichprobe der solche Verunreinigungen ( Abbildung 4). Künftige Anpassungen können umfassen die Verwendung von einem französischen Presse oder Stickstoff Bombe stören die Zellmembran schonender und weiter verringern Verunreinigungen der CLD isolieren2.

Zusammenfassend ist das ER Kit LD Isolationsmethode eine neuartige Anwendung eines häufig verwendeten Zellbiologie-Tools. Diese Methode führt ebenso zu Saccharose gradient Isolation, mit weniger Vorbereitung Reagenz. Darüber hinaus verbessert die Aufnahme von vorbereiteten Reagenzien im ER Set LD Isolierung Protokoll die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der experimentellen Bedingungen.

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Disclosures

Dr. Carr wird vom Abfangen Pharma Forschung unterstützt.

Acknowledgments

Wir danken der Abramson Familie Cancer Research Institute. Diese Arbeit wird unterstützt durch folgende Zuschüsse: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos Medical Faculty Development Award, 7158, IDOM DRK Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH P30-DK050306 unterstützt und seine Kern-Einrichtungen (Molekularpathologie und Imaging Core, Molekularbiologie/Gene Expression Kern und Kultur Zellkern) und der Pilot Programm gewähren. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioExpress Vortex Mixer GeneMate S-3200-1 Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R Eppendorf 54242 R Refrigerated Counter Microcentrifuge
Rotor: FA-45-24-11
Centrifuge Sorvall RC6 + Thermo Scientific RC6+ Refrigerated High Speed Centrifuge
Rotor: F21S-8x50y
Centrifuge Sorvall Legend RT+ Thermo Scientific Legend RT+ Refrigerated High Capacity Centrifuge
Rotor: 75006445 Bucket: 75006441
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma Aldrich 04 693 116 001 Protease Inhibitor Tablets
Diagenode Bioruptur UCD-200 Diagenode UCD-200 Sonication System
Dounce Tissue Grinder (45 mL) Wheaton 357546 Use Loose pestle
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) Corning 21-031-CM
Endoplasmic Reticulum Isolation Kit Sigma Aldrich ER0100 For ER kit Extraction:
Contains:
Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL
Hypotonic Extraction Buffer 10 mL
Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL
OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL
Blunt Nosed Needle 1 ea.
External light source for flourescent excitation Leica Leica EL6000
Hydrochloric acid Sigma Aldrich H1758 Hydrochloric Acid
ImageJ Image Analysis Software
Inverted Modulating Contrast Microscope Leica Leica DM IRB
Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells Thermo Fisher Scientific 89839 For Lysosome Isolation
Microscope Camera Qimaging QICAM fast 1394
Optima XL-100K Ultracentrifuge Beckman-Coulter XL-100K Ultracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 22-042817
Petri Dish 5 cm Fisher Scientific FB0875713A
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
PhosSTOP Sigma Aldrich 04 906 845 001 Phosphatase Inhibior Tablets
Sterile Surgical Blade #10 Pioneer S2646
Sucrose Fisher Scientific S5-500 Crystalline/Certified ACS
Triglyceride Liquicolor Kit Stanbio  2200-225 Colorimetric Triglyceride kit
Tris Base Fisher Scientific BP152-1 For TE buffer
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151-100 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent
UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) Thermo Fisher Scientific 15575-038 For TE buffer

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References

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Biologie Ausgabe 146 Lipid Droplet Isolation Leber Perilipin 2 endoplasmatische Retikulum gradient isotonische Extraktionspuffer Saccharose
Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit
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Brettschneider, J., Correnti, J. M., … More

Brettschneider, J., Correnti, J. M., Lin, C., Williams, B., Oranu, A., Kuriakose, A., McIver-Jenkins, D., Haba, A., Kaneza, I., Jeon, S., Scorletti, E., Carr, R. M. Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit. J. Vis. Exp. (146), e59290, doi:10.3791/59290 (2019).

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