Summary

تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

Published: March 15, 2019
doi:

Summary

وتعرض هذه الورقة طريقة جراحية لتشريح المورفولوجية شبكية العين الخوادر جنبا إلى جنب مع بروتوكولات لمعالجة الأنسجة إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، واستخراج الحمض النووي الريبي.

Abstract

الشبكية الخوادر المورفولوجية يوفر نظام نموذجا ممتازا لدراسة العمليات morphogenetic أثناء التطوير. في هذه الورقة، نقدم بروتوكول موثوقة لتشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية الدقيقة. نهجنا الجراحية يستخدم أدوات ميكروديسيكشن–متاحة بسهولة لفتح الخوادر ودقة استخراج مجمعات العين والدماغ. هذه يمكن ثابتة، ويتعرضون إيمونوهيستوتشيميستري، وشبكية العين ثم شنت على شرائح المجهر وتصويرها إذا كان الهدف الكشف عن الهياكل الخلوية أو سوبسيلولار. بدلاً من ذلك، يمكن تكون معزولة عن أنسجة المخ شبكية العين غير المثبتة وتفكيك في المخازن المؤقتة المناسبة وتستخدم لاستخراج التفريد أو مرناً هلام بروتين (لتقييم تعبير البروتين أو الجينات، على التوالي). ممارسة هامة والصبر قد يكون مطلوباً للماجستير في بروتوكول ميكروديسيكشن ووصف، ولكن حالما يتقن، البروتوكول يمكن عزلة سريعة نسبيا من شبكية العين أساسا غير التالفة.

Introduction

المورفولوجية الشبكية تتكون من حوالي 750 ommatidia محاطة بالخلايا الصبغية مرتبة في قرص العسل شعرية1،2،،من34. كل أوماتيديوم يحتوي على ثمانية من الخلايا العصبية مستقبله وأربع خلايا المخروط إفراز عدسة خليتين الصباغ الأولية. المحيطة بكل أوماتيديوم هي الخلايا المنتجة لصبغة شعرية ومجموعات شعيرات حسية. نظراً للطبيعة الانقسامية بعد وترتيب سداسية النمطية، يوفر الشبكية الخوادر المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة العمليات مورفوجينيتيك بما في ذلك خلية التصاق5،6، 7،،من89،10 والمبرمج11،12،13،،من1415.

تستخدم العديد من البروتوكولات المنشورة ضغط الهواء لاستخراج مجمعات العين والدماغ من المورفولوجية الخوادر16،،من1718. البروتوكول هو موضح هنا بدلاً من ذلك يستخدم أدوات ميكروديسيكشن بعناية ودقة عزل مجمعات العين والدماغ بهدف الحصول على نسيج الشبكية غير التالفة. هذا أمر بالغ الأهمية إذا كانت ستستخدم لشبكية العين المورفولوجية، والبروتين، أو التعبير الجيني يحلل حيث يمكن أن يؤدي إلى تلف شبكية العين الإجهاد الخلوية أو الموت، والتي يمكن أن تعدل تعبير النمط الظاهري أو الجينات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، بعد الممارسة، يمكن أن تكون معزولة في 10 إلى 15 دقيقة، تيسير تحقيق هدف تقليل التقلبات في العمر ومرحلة النمو من نسيج العين تشريح 6 إلى 10 مجمعات العين والدماغ.

التثبيت، وإيمونوستينينج، وبروتوكول الجامعة-جبل الموصوفة أدناه مناسبة لإعداد عيون المورفولوجية للفحص المجهري نيون. يمكن المحتضنة شبكية العين مع الأجسام المضادة لاستهداف البروتينات ذات الاهتمام. على سبيل المثال، يمكن استخدام أجسام مضادة لمكونات مفرق أدهيرينس تصور سيركومفيرينسيس قمي من الخلايا حتى تكون الخصائص بما في ذلك نوع الخلية، الشكل والترتيب المقررة19. قبل التثبيت، يمكن بدلاً من ذلك أن المشقوق عيون من الدماغ غرض استخراج البروتين للتحليل الغربي، أو الحمض النووي الريبي للاستخدام في قرة-PCR أو تسلسل الحمض النووي الريبي.

Protocol

1-إعداد الأنسجة إعداد المورفولوجية الصلبان (كما تم وصفه سابقا20) أو ثقافة معينة سلالات المورفولوجية للحصول على الخوادر للنمط الوراثي المطلوب. للتأكد من أن ظهور عدد كبير من الخوادر بالصدفة، تنشئ هذه الثقافات يطير في مكررة على الأغذية الغنية بالمغذيات وسائط أو وس…

Representative Results

العين الخوادر هو أنسجة يسهل الوصول إليها بمثابة نموذج ممتاز للتحقيق في العمليات الإنمائية morphogenesis محرك الأقراص هذا. هنا، نحن قد تشريح شبكية العين واستخدمت الفلورة للكشف عن الوصلات أدهيرينس قمي (الشكل 3 ألف، جيم) أو caspase Dcp-1 (الشكل 3D) التي يتم تفعيلها…

Discussion

طريقة تشريح العين الخوادر المورفولوجية الموصوفة هنا يسمح للعزلة من 6 إلى 10 مجمعات العين في الدماغ خلال 10 إلى 15 دقيقة. ومع ذلك، الصبر والممارسة ضرورية بغية إتقان تقنية تشريح وتحسين نوعية وسرعة من تشريح. يضمن هذا الوقت القصير تشريح كل عين تقريبا المرحلة الإنمائية ذاتها، الحد من تقلب في ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر طبل زاك ولدينا المراجعين لتعليقات مفيدة على المخطوطة. وأيد هذا العمل R15GM114729.

Materials

Adobe Photoshop Adobe Image processing software
Bamboo splints, 6"  Ted Pella Inc 116
Beta mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Beta-glycerol phosphate Sigma-Aldrich 50020
Black dissecting dish Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder Fine Science Tools 10053
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche 4693132001
Confocal microscope (Zeiss LSM 501) Carl Zeiss or similar microscope
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 40718
Double-sided tape 3M 665
Drosophila food media, nutrient-rich  7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila food media, standard Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.  (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758
Fixative solution 4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) Leica Microsystems or similar microscope
Forceps  Fine Science Tools 91150-20 Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde Thermo Scientific 28908
Glass 9-well dishes  Corning 7220-85 Also known as 9-well dishes 
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) Fisher Scientific 12-550-413
Glass petri dish Corning 3160-100BO
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Image Studio software version 5.2.5 LI-COR Biosciences Image processing software for quantitation of Western blots.
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions.
Lane marker reducing sample buffer  ThermoFisher Scientific 39000 5X concentrated protein sample buffer.
Microcentrigure tubes  Axygen MCT-175-C
Microdissection scissors  Fine Science Tools 15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells) Nunc 438733
Mounting media 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate Sigma-Aldrich P3130
Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) Sigma-Aldrich P5368 Prepare according to manufacturer's instructions
PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4.  
PBT 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder Fine Science Tools 26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH Imgenex IMG-3073 For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 Cell signaling 9578S For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad Developmental Studies Hybridoma Bank DCAD2 For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 DCAD1  Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit  Promega Z6110
Rnase decontamination reagent (RNase Away) Molecular BioProducts 7002
Scalpel blades Fine Science Tools 10050 Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated  donkey anti-rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 712-545-153 For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-165-144 For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Cell Signaling Technology 7077 For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 305-035-003 For Western blotting. Used at 1:3000
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich 215309
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 50860
Spectrophotometer (NanoDrop) ThermoFisher Scientific 2000c 
Stereo dissecting microscope (M60 or M80) Leica Microsystems or similar microscope
Sylgard (black) Dow Corning SYLG170
Sylgard (transparent) Dow Corning SYLG184 Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes KIMTECH 34120
TritonX Sigma-Aldrich T8787
Trizma hydrochloride pH7.5 Sigma-Aldrich T5941
Tungsten needle, fine Fine Science Tools 10130-10 Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy Fine Science Tools 10130-20 Insert into pin holder
WTLB (western tissue lysis buffer) 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.
Yeast paste (local supermarket) Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O

References

  1. Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
  2. Wolff, T., Ready, D. . The development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
  5. Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
  6. Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
  7. Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
  8. Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
  9. Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
  10. Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
  11. Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
  12. Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
  13. Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
  14. Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
  15. Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Biologie du développement. 433 (1), 94-107 (2018).
  16. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  17. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
  18. Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
  19. Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
  20. Greenspan, R. J. . Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  22. Ellis, M. C., O’Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
  23. Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
  25. Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
  26. Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).

Play Video

Citer Cet Article
DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation. J. Vis. Exp. (145), e59299, doi:10.3791/59299 (2019).

View Video