分化后再蛋白的人类多能干细胞衍生神经元，用于高含量的内尿成生和突合性成熟筛查
Summary
该协议描述了一个详细的程序，用于重新悬浮和培养人类干细胞衍生神经元，这些神经元以前在体外与神经祖细胞分离了数周。该程序有助于以与光显微镜和高含量筛选相兼容的格式对神经亮物、突触和晚表达神经元标记进行基于成像的检测。
Abstract
在二维培养中与人类多能干细胞衍生神经祖细胞（NPC）区分的神经元，是探索疾病机制和进行高含量筛选（HCS）以询问化合物的强大模型系统库或识别基因突变表型。然而，随着人类细胞从NPC过渡到功能，成熟的神经元需要几个星期。突触通常在单层培养中分化 3 周后开始形成，并且几种神经元特异性蛋白质（例如后来表达的泛神经元标记 NeuN 或第 5/6 层脑皮质神经元标记 CTIP2）开始表达分化后约4-5周。这种较长的区分时间可能与用于小容量多井 HCS 平台的最佳培养条件不兼容。许多挑战包括需要粘附良好、均匀分布的细胞，并实现最小的细胞聚类，以及培养促进长期活力和功能突触成熟的过程。一种方法是以大体积格式区分神经元，然后在 HCS 兼容多孔的稍后时间点重新加板。使用这种再镀层方法时，由于树突状和斧状网络的紧张中断，一些主要的挑战涉及可重复性和细胞活力。在这里，我们演示了酶重新悬浮人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生神经元的一个详细和可靠的程序，在它们分化4-8周后，以大体积的形式，将它们转移到384孔微蒂板，并培养他们进一步1-3周与优秀的细胞生存。这种人类神经元的再光，不仅允许在两周内研究突触组装和成熟，而且还能研究神经素再生和生长锥体特性。我们使用384井平台为神经生成和突触发生提供可扩展的测定示例。
Introduction
人类多能干细胞（hiPSC）衍生的神经元在基础研究、药物开发和再生医学领域越来越相关。工作流程和程序，以优化他们的文化和维护，提高效率分化成特定的神经元亚型，正在迅速演变1，2。为了提高人类干细胞衍生神经元的效用和成本效益，作为在药物发现和目标验证中适应高含量分析的模型系统，减少成熟、功能性生成所需的培养时间是有益的神经元，同时保持最大的鲁棒性、可重复性和表型相关性。虽然三维有机体培养物正在推动神经发育研究的突破3，但二维单层培养物由于其最小的组织厚度，与基于自动成像的应用特别兼容。
然而，根据人类神经和神经发育疾病模型调整基于成像的筛查方法面临重大挑战。人类神经系统在体内成熟的漫长时间要求延长培养时间，以适应基因表达的自然程序，实现神经元成熟。
冗长的神经元分化程序的一个实际后果是，hiPSC衍生的单层培养物的维持必须持续数周，以实现足够的突触成熟。在此期间，保持未分化的神经祖体继续分裂。这些可以迅速过度生长的培养和篡夺所需的营养成分，以保持可行的后分体神经元。大力分割神经祖细胞（NPC）也可以与神经元竞争生长基质。这会使这些培养物受到粘附不良问题的影响，这种情况不适合基于成像的测定。此外，许多研究者发现，培养体积越小，维持健康人群的分化神经元的难度越大，足以观察神经元分化的晚期。换句话说，使用高含量筛选 （HCS） 方法进行突触成熟检测对于人类衍生的神经元来说可能非常具有挑战性。
为了规避其中一些问题，使用了重新悬浮和重新镀层以前分化的hiPSC衍生神经元的过程。首先，它允许研究神经质外生长（或更准确地说，神经质再生）在完全承诺的神经元群体。其次，将先前分化的神经元从大体积格式（如 10 厘米板或更大）重新调出，再到小体积格式（如 HCS 兼容的 96 或 384 孔微小质板），可显著减少总培养时间。小体积条件。这有利于研究突触组装和随后在体外几周的成熟。
然而，已经建立长神经酸盐和复杂连接网络的成熟神经元的重新电化带来了几个挑战，其中之一是细胞死亡率有时很高且可变。在这里，我们描述了一个再电化过程，它能产生优异的细胞存活率和可重复性。通常，神经元暴露于蛋白水解酶短的潜伏期（通常±3-10分钟），以便在三次三次分离之前从基质分离细胞。这个短暂的蛋白解时间通常用于重新悬浮和传递许多类型的分裂细胞，包括非神经细胞和未分化的祖细胞4，5，6。然而，对于具有长、相互连接的神经质的分化神经元，不仅要从基底分离细胞，而且必须破坏树突状和斧状网络，以便分离单个细胞，同时尽量减少损伤。事实上，神经元的厚网状通常倾向于从基底分离为单个表，而不是单个细胞。如果不注意放松厚厚的神经酸盐网络，神经元不仅在三聚过程中变得不可逆转地受损，而且其中许多神经元无法通过用于去除团块的过滤器，导致细胞产量差。下面我们描述了对广泛使用的蛋白酶孵化程序的简单修改，以对抗这些困难。
在下面描述的协议中，神经元用温和的蛋白酶（如蛋白酶）孵育40-45分钟，如蛋白酶（例如，Accutase）。在加入酶后的前 5-10 分钟，神经元网络从基底以片形上升出。在进行温和的三聚和过滤之前，使用蛋白酶孵育30-40分钟。这种额外的孵育时间有助于确保材料的消化放松细胞间网络，从而确保随后的三次三次培养产生单个细胞的悬浮。此过程在重新镀层时最大化细胞分布的均匀性，同时最大限度地减少细胞死亡。我们已经成功地将这种再电化方法应用于由各种分化协议7、8和从HiPSCs各行生成的hiPSC衍生神经元培养物。该程序名义上适用于大多数或所有干细胞衍生神经元的行。我们观察到，延长蛋白酶孵育时间对于从小尺寸板（例如直径35毫米）重新镀层培养物并非绝对必要;然而，正如我们在这里展示的，它提供了一个显著的好处，当从大直径板（例如，直径10厘米或更大），可能是因为神经酸盐在此类板可以延长很长的过程，并形成一个密集互连的阵列。
在这里，我们演示了这种方法，并简要说明了它在早期神经生成和突触成熟测定中的应用，这涉及到沿树突和斧头聚集前和后发蛋白，然后它们后来在突触部位进行联合定位。这些示例强调了该协议在保持细胞活力和可重复性方面的优势。首先，它允许研究者研究人类神经发生的早期步骤。实验环境类似于常用的啮齿动物皮质或海马神经元的主要培养物，其中细胞从晚期胎儿或产后早期大脑提取，在温和的蛋白酶治疗后通过三聚体分离，并允许启动神经酸盐或再生在程序9，10中被切断的中微子。与这种啮齿动物原神经元类似，hiPSC衍生的神经元在重新镀层后几小时内开始形成或再生其神经质，允许在最佳环境中对生长锥和神经质形态进行成像，而较少周围未分化的细胞。我们观察到，与神经元首次开始从祖体群中分化时看到的可变延迟和不同的生长速率相比，神经质外生长更加同步。此外，重新镀层能够检测神经元表达神经元亚型标记，通常出现在稍后的神经发育，如皮质层5/6转录因子CTIP2（鸡奥巴平上游启动子转录因子相互作用蛋白2），或泛神经元标记NeuN1。重新镀层方法的一个特别有用的特征是突触发生在与HCS兼容的时限内进行。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们展示了一种直接的人类神经元培养物的再悬浮和再镀层程序，以与高含量筛选平台兼容的方式优化生存能力、分化成功和亚细胞成像，和其他与药物发现有关的测定。图 6说明了整个工作流和此类应用程序的示例。
虽然在这里，我们专注于hiPSC衍生的神经元，这是针对皮质神经元的命运，我们期望这种方法应同样适用于人类胚胎干细胞衍生神经元，?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是国家合作重新编程细胞研究小组（NCRCRG）研究精神疾病的组成部分，并得到了NIH2015-0644年U19MH1资助。初步工作也得到了NIH赠款NS070297的支持。我们感谢Salk研究所的卡罗尔·马尔切托博士和弗雷德·盖奇博士提供了WT 126线的神经祖细胞，以及加州大学圣地亚哥分校的尤金·杨博士和劳伦斯·戈德斯坦博士提供了CVB WT24线的神经祖细胞。我们感谢黛博拉·普雷在安妮·邦博士的实验室，桑福德·伯纳姆·普雷比斯医学发现研究所，有益的讨论。
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
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