Post-Differenzierung Replating von Human Pluripotent Stem Cell abgeleiteten Neuronen für High-Content Screening von Neuritogenese und Synapse Reifung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Aussetzung und Kultivierung von neuronen menschlichen Stammzellen, die zuvor mehrere Wochen lang von neuronalen Vorläufern in vitro unterschieden wurden. Das Verfahren erleichtert bildgebende Assays von Neuriten, Synapsen und spät exemitten neuronalen Markern in einem Format, das mit Lichtmikroskopie und High-Content-Screening kompatibel ist.
Abstract
Neuronen, die in der zweidimensionalen Kultur von menschlichen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) unterschieden werden, stellen ein leistungsfähiges Modellsystem dar, um Krankheitsmechanismen zu erforschen und ein hochgehaltiges Screening (HCS) durchzuführen, um Verbindungen zu verhören. oder Genmutationsphänotypen zu identifizieren. Bei menschlichen Zellen dauert der Übergang vom NPC zum funktionellen, reifen Neuron jedoch mehrere Wochen. Synapsen beginnen sich in der Regel nach 3 Wochen Differenzierung in der Monolayer-Kultur zu bilden, und mehrere neuronspezifische Proteine, z. B. der später exprimierende panneuronale Marker NeuN, oder die Schicht 5/6 zerebralen kortikalen Neuronenmarker CTIP2, beginnen auszudrücken ca. 4-5 Wochen nach der Differenzierung. Diese lange Differenzierungszeit kann mit optimalen Kulturbedingungen für kleine, multi-well-HCS-Plattformen nicht kompatibel sein. Zu den vielen Herausforderungen gehören die Notwendigkeit gut haftender, gleichmäßig verteilter Zellen mit minimalem Zellclustering und Kulturverfahren, die die langfristige Lebensfähigkeit und die funktionelle Synapsenreifung fördern. Ein Ansatz besteht darin, Neuronen in einem großen Volumenformat zu differenzieren und sie dann zu einem späteren Zeitpunkt in HCS-kompatiblen Multi-Wells neu zu zeichnen. Einige der Hauptherausforderungen bei der Verwendung dieses Replating-Ansatzes betreffen die Reproduzierbarkeit und Zelllebensfähigkeit aufgrund der belastenden Störung des dendritischen und axonalen Netzwerks. Hier zeigen wir ein detailliertes und zuverlässiges Verfahren zur enzymatischen Suspendierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell (hiPSC)-abgeleiteten Neuronen nach ihrer Differenzierung für 4-8 Wochen in einem großvolumigen Format und übertragen sie auf 384-Well-Mikrotiter und kultivieren sie für weitere 1-3 Wochen mit ausgezeichnetem Zellüberleben. Diese Replatierung menschlicher Neuronen ermöglicht nicht nur die Untersuchung der Synapsenmontage und Reifung innerhalb von zwei Wochen nach der Replatierung, sondern ermöglicht auch Studien zur Neuritregeneration und Wachstumskegeleigenschaften. Wir liefern Beispiele für skalierbare Assays für Neuritogenese und Synaptogenese mit einer 384-Well-Plattform.
Introduction
Humane pluripotente Stammzell (hiPSC)-abgeleitete Neuronen sind zunehmend relevant in den Bereichen Grundlagenforschung, Arzneimittelentwicklung und regenerative Medizin. Workflows und Verfahren zur Optimierung ihrer Kultur und Wartung und zur Verbesserung der Effizienz der Differenzierung in bestimmte neuronale Subtypen entwickeln sich schnell1,2. Um den Nutzen und die Kostenwirksamkeit menschlicher Stammzellen-abgeleiteter Neuronen als Modellsysteme zu verbessern, die für hochklassige Analysen in der Arzneimittelentdeckung und Zielvalidierung geeignet sind, ist es sinnvoll, die Kultivierungszeit zu verringern, die erforderlich ist, um ausgereifte, funktionelle Unter Beibehaltung maximaler Robustheit, Reproduzierbarkeit und Phänotyprelevanz. Obwohl dreidimensionale organoide Kulturen den Durchbruch inder Neuroentwicklungsforschung vorantreiben 3, sind 2-dimensionale Monolayer-Kulturen aufgrund ihrer minimalen Gewebedicke besonders kompatibel mit automatisierten bildgebenden Anwendungen.
Die Anpassung bildgebender Screening-Methoden an Modelle menschlicher neurologischer und neuroentwicklungsbasierter Erkrankungen steht jedoch vor einer großen Herausforderung. Der lange Zeitrahmen, über den das menschliche Nervensystem in vivo reift, erfordert eine längere Zeit in der Kultur, um natürliche Programme der Genexpression aufzunehmen und eine neuronale Reifung zu erreichen.
Eine praktische Folge des langwierigen neuronalen Differenzierungsprogramms ist, dass die Aufrechterhaltung von hiPSC-abgeleiteten Monolayer-Kulturen für viele Wochen aufrechterhalten werden muss, um eine angemessene Synapsenreife zu erreichen. Während dieser Zeit, neuronale Vorläufer, die undifferenziert bleiben weiterhin zu teilen. Diese können schnell die Kultur überwuchern und den Nährstoffgehalt an sich reißen, der erforderlich ist, um lebensfähige postmitotische Neuronen aufrechtzuerhalten. Kräftig trennende neuronale Vorläuferzellen (NPCs) können auch mit Neuronen um das Wachstumssubstrat konkurrieren. Dies kann solche Kulturen Zufall von Problemen der schlechten Haftung machen, eine Bedingung, die für bildgebende Assays ungeeignet ist. Darüber hinaus stellen viele Forscher fest, dass je kleiner das Kulturvolumen, desto größer die Schwierigkeit bei der Aufrechterhaltung gesunder Populationen von differenzierten Neuronen lange genug, um die späten Stadien der neuronalen Differenzierung zu beobachten. Mit anderen Worten, Assays der Synapsenreifung mit HIGH-Content-Screening -Ansätzen (HCS) können für vom Menschen abgeleitete Neuronen eine große Herausforderung darstellen.
Um einige dieser Probleme zu umgehen, wurde ein Verfahren zum Resuspendieren und Replatieren von zuvor differenzierten hiPSC-abgeleiteten Neuronen verwendet. Erstens ermöglicht es die Untersuchung des Neuritenwachstums (oder genauer gesagt der Neuritenregeneration) in einer Population voll engagierter Neuronen. Zweitens ermöglicht die Replatierung von zuvor differenzierten Neuronen von einem großvolumigen Format (z. B. 10 cm Platten oder größer) bis hin zu kleinen Volumenformaten (wie HCS-kompatible 96- oder 384-Well-Mikrotiterplatten) eine signifikante Reduzierung der Gesamtkultivierungszeit in die kleine Lautstärkebedingung. Dies erleichtert die Untersuchung der Synapsenmontage und Reifung in den folgenden Wochen in vitro.
Die Wiederherstellung von ausgereiften Neuronen, die bereits lange Neuriten und ein komplexes Konnektivitätsnetzwerk etabliert haben, stellt jedoch mehrere Herausforderungen dar, von denen eine die manchmal hohe und variable Rate des Zelltodes ist. Hier beschreiben wir ein Replating-Verfahren, das zu einem ausgezeichneten Zellüberleben und Reproduzierbarkeit führt. Üblicherweise sind Neuronen proteolytischen Enzymen für kurze Inkubationsperioden (in der Regel 3-10 min) ausgesetzt, um Zellen vor der Trituration vom Substrat zu lösen. Diese kurze Proteolysezeit wird üblicherweise für das Resuspendieren und Passieren vieler Arten von teilenden Zellen verwendet, einschließlich nicht-neuronaler Zellen und undifferenzierter Vorläufer4,5,6. Für differenzierte Neuronen mit langen, miteinander verbundenen Neuriten ist es jedoch wichtig, nicht nur Zellen vom Substrat zu lösen, sondern auch das dendritische und axonale Netzwerk zu stören, um einzelne Zellen zu isolieren und gleichzeitig Schäden zu minimieren. Tatsächlich neigt ein dickes Netz von Neuronen in der Regel dazu, sich als einzelnes Blatt vom Substrat zu lösen, anstatt als einzelne Zellen. Wenn nicht darauf geachtet wird, das dicke Netz von Neuriten zu lösen, werden Neuronen nicht nur während der Trituration irreversibel geschädigt, sondern viele von ihnen passieren nicht den Filter, der verwendet wird, um Klumpen zu entfernen, was zu einer schlechten Zellausbeute führt. Im Folgenden beschreiben wir eine einfache Änderung an einem weit verbreiteten Protease-Inkubationsverfahren, um diesen Schwierigkeiten entgegenzuwirken.
In dem unten beschriebenen Protokoll werden Neuronen für 40-45 min mit einer milden Protease, wie dem proteolytischen Enzym (z. B. Accutase), inkubiert. Während der ersten 5-10 min nach Zugabe des Enzyms hebt sich das neuronale Netzwerk als Blatt vom Substrat ab. Die Inkubation mit der Protease erfolgt für weitere 30-40 min, bevor es mit sanfter Triturierung und Filterung geht. Diese zusätzliche Inkubationszeit trägt dazu bei, dass die Verdauung des Materials das interzelluläre Netzwerk entspannt und somit sicherstellt, dass die nachfolgende Trituration zu einer Suspension einzelner Zellen führt. Dieses Verfahren maximiert die Gleichmäßigkeit der Zellverteilung beim Replatieren bei gleichzeitiger Minimierung des Zelltodes. Wir haben diese Replating-Methode erfolgreich auf hiPSC-abgeleitete neuronale Kulturen angewendet, die durch verschiedene Differenzierungsprotokolle7,8 und aus verschiedenen Zeilen von hiPSCs erzeugt werden. Das Verfahren ist nominell für die Verwendung mit den meisten oder allen Linien von Stammzell-abgeleiteten Neuronen geeignet. Wir haben festgestellt, dass eine verlängerte Protease-Inkubationszeit für die Replatierung von Kulturen aus Kleinformatplatten (z. B. 35 mm Durchmesser) nicht unbedingt erforderlich ist; Wie wir hier zeigen, bietet es jedoch einen erheblichen Vorteil bei der Replatierung von Platten mit großem Durchmesser (z.B. 10 cm Durchmesser oder größer), wahrscheinlich weil Neuriten in solchen Platten sehr lange Prozesse ausdehnen und ein dicht miteinander verbundenes Array bilden können.
Hier zeigen wir diese Methode und veranschaulichen kurz ihre Anwendung in Assays für die frühe Neuritogenese und für die Synapsenreifung, die das Clustern von prä- und postsynaptischen Proteinen entlang der Dendriten und Axone beinhaltet, gefolgt von deren späteren Kolokalisierung an synaptischen Standorten. Die Beispiele zeigen die Vorteile dieses Protokolls bei der Erhaltung der Zelllebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit. Erstens erlaubt es den Forschern, frühe Schritte in der menschlichen Neuritogenese zu untersuchen. Die experimentelle Umgebung ähnelt den häufig verwendeten Primärkulturen von Nagetierkortikal- oder Hippocampus-Neuronen, bei denen Zellen aus dem späten fetalen oder frühen postnatalen Gehirn extrahiert, durch Trituration nach sanfter Proteasebehandlung dissoziiert und erlaubt werden, Neuriten initiieren oder Neuriten regenerieren, die im Verfahren9,10abgetrennt wurden. Ähnlich wie solche Nagetier-Primärneuronen beginnen hiPSC-abgeleitete Neuronen ihre Neuriten innerhalb von Stunden nach der Replatierung zu bilden oder zu regenerieren, was die Abbildung von Wachstumskegeln und Neuritenmorphologie in einer Umgebung ermöglicht, die für eine hohe raumzeitliche Bildgebung mit weniger umsiebende undifferenzierte Zellen. Wir haben beobachtet, dass das Neuritenwachstum im Vergleich zu den variablen Verzögerungen und unterschiedlichen Auswuchsraten, die beobachtet werden, wenn Neuronen zum ersten Mal beginnen, sich von einer Vorläuferpopulation zu unterscheiden, stärker synchronisiert ist. Darüber hinaus ermöglicht die Replatierung Assays von Neuronen, die neuronale Subtypmarker exemiten, die typischerweise später in der neuronalen Entwicklung auftreten, wie z. B. der kortikale Schicht 5/6 Transkriptionsfaktor CTIP2 (Chicken ovalbumin upstream promoter transcription Faktor-interagierendes Protein 2) oder den pan-neuronalen Marker NeuN11. Ein besonders nützliches Merkmal des Replating-Ansatzes ist, dass die Synaptogenese innerhalb eines mit HCS kompatiblen Zeitrahmens verläuft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben ein geradliniges Verfahren zur Resuspension und Replatierung menschlicher neuronaler Kulturen demonstriert, das die Lebensfähigkeit, den Differenzierungserfolg und die subzelluläre Bildgebung in einer Weise optimiert, die mit Screening-Plattformen mit hohem Inhalt kompatibel ist. und andere Assays, die für die Entdeckung von Arzneimitteln relevant sind. Abbildung 6 zeigt den gesamten Workflow und Beispiele für solche Anwendungen.
Obwohl wir uns hier …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit ist Bestandteil der National Cooperative Reprogrammed Cell Research Groups (NCRCRG) zur Untersuchung psychischer Erkrankungen und wurde durch das NIH-Stipendium U19MH1 2015-0644 unterstützt. Die ersten Arbeiten wurden auch durch den NIH-Zuschuss NS070297 unterstützt. Wir danken Dr. Carol Marchetto und Fred Gage, The Salk Institute, für die Bereitstellung der WT 126 Linie von neuronalen Vorläuferzellen, und Dr. Eugene Yeo und Lawrence Goldstein, UC San Diego für die Bereitstellung der CVB WT24 Linie von neuronalen Vorläuferzellen. Wir danken Deborah Pre im Labor von Dr. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, für nützliche Diskussionen.
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
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