Beeldverwerking Protocol voor de analyse van de verspreiding en de clustergrootte van membraan receptoren door fluorescentie microscopie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor één deeltje beeldanalyse waarmee kwantitatieve evaluatie van diffusie coëfficiënten, soorten van beweging en cluster grootte van enkele deeltjes ontdekt door fluorescentie microscopie bijhouden.
Abstract
Deeltje bijhouden op een videofragment en de achterste analyse van hun trajecten is tegenwoordig een gemeenschappelijke operatie in veel biologische studies. Met behulp van de analyse van de celmembraan receptor clusters als een model, presenteren we een gedetailleerd protocol voor deze afbeelding analyse taak met behulp van Fiji (ImageJ) en Matlab routines voor: 1) definiëren gebieden van belang en ontwerpen van maskers aangepast aan deze regio’s; 2) bijhouden van de deeltjes in de fluorescentie microscopie video’s; 3) analyseren de kenmerken van de verspreiding en de intensiteit van geselecteerde tracks. De kwantitatieve analyse van de coëfficiënten van de verspreiding, de soorten bewegingen en een clustergrootte verkregen door fluorescentie microscopie en beeldverwerking biedt een waardevol hulpmiddel om objectief vast deeltje dynamiek en de gevolgen van het wijzigen milieu-omstandigheden. In dit artikel presenteren we gedetailleerde protocollen voor de analyse van deze functies. De beschreven methode hier kunt niet alleen single-molecuul tracking detectie, maar ook automatiseert de schatting van de parameters voor de laterale verspreiding op het celmembraan, classificeert het type traject en het volledige analyse dus overwinnen stelt de problemen in het kwantificeren van de grootte van de plek over zijn gehele traject op de celmembraan.
Introduction
Membraaneiwitten ingebed in de lipide dubbelgelaagde zijn in continue beweging als gevolg van thermische diffusie. Hun dynamiek zijn essentieel voor het reguleren van de antwoorden van de cel, zoals Intermoleculaire interacties toestaan vorming van complexen die variëren in grootte van monomeren tot oligomeren en invloed hebben op de stabiliteit van complexen signalering. Het ophelderen van de mechanismen beheersen eiwit dynamiek is dus een nieuwe uitdaging in de celbiologie, vereist voor het begrijpen van signaaltransductie trajecten en omgaan met onverwachte cel.
Sommige optische methodes ontwikkeld om te studeren van deze interacties in levende cellen1. Daaronder staat de totale interne reflectie (TIRF) fluorescentie microscopie, ontwikkeld in de vroege jaren 1980, de studie van moleculaire interacties op of vlakbij de celmembraan2. Studeren dynamische parameters membraan eiwit gevaar opleverende verkregen TIRF gegevens in levende cellen, is een enkel deeltje tracking methode (SPT) vereist. Hoewel verschillende algoritmen beschikbaar voor dit zijn, wij gebruiken momenteel die zijn gepubliceerd door Jaqaman et al.3 , die betrekking hebben op particle beweging heterogeniteit in een dichte deeltje veld door deeltjes tussen opeenvolgende frames om verbinding te maken met de resulterende track te koppelen segmenten in volledige trajecten (tijdelijke deeltje verdwijnen). De software vangt het deeltje samenvoegen en splitsen van dat resultaat van aggregatie en dissociatie gebeurtenissen3. Één van de uitvoergegevens van deze software is de detectie van de deeltjes langs het hele traject door hun X- en Y-posities in elk frame te definiëren.
Zodra de deeltjes worden geconstateerd, passen we verschillende algoritmen om te bepalen van de korte tijdsverschil diffusie coëfficiënt (D1-4)4,5. Door het Moment schalen Spectrum (MSS)6,7,8 analyse toe te passen of door het aanbrengen van de ‘alpha’-waarde door aanpassing van de verplaatsing (MSD) van de gemiddelde plein aan de kromme9, indelen we ook de deeltjes volgens het type traject.
Analyse van plek intensiteit in fluorescentie beelden is een gedeelde doelstelling voor wetenschappers in het veld10,11. De meest voorkomende algoritme is het zogenaamde aantal en helderheid. Deze methode toch staat geen detectie van de juiste frame-voor-frame intensiteit in deeltjes in de mobiele Fractie. We hebben dus een nieuw algoritme te evalueren deze deeltje intensiteiten frame-voor-frame en te bepalen wat de status van hun aggregatie gegenereerd. Zodra de coördinaten van elk deeltje worden gedetecteerd met behulp van U-Track2 software3, definiëren we de intensiteit in elk frame over het volledige traject, ook rekening houdend met de celachtergrond in elk frame. Deze software biedt verschillende mogelijkheden om te bepalen van de intensiteit van de plek en de achtergrond van de cel en berekent op basis van bekende monomeer en dimeric eiwitten als verwijzingen, het geschatte aantal eiwitten in het deeltje ontdekt (clustergrootte).
In dit artikel beschrijven we een zorgvuldige gids voor het uitvoeren van deze drie stappen: 1) opsporen en volgen enkele deeltjes langs een video van fluorescentie microscopie met behulp van U-track; 2) analyseren de momentane diffusie coëfficiënt (D1-4) van die deeltjes en het soort verkeer (beperkt, vrije of gerichte) van deeltjes met lange trajecten door MSS begint; 3) het meten van de plek intensiteit langs de video gecorrigeerd door de fluorescentie van de geschatte achtergrond voor elke vlek. Hierdoor cluster grootte schatting en identificatie van de photobleaching stappen.
Het gebruik van dit protocol niet vereist gespecialiseerde vaardigheden en kan worden uitgevoerd in een laboratorium met celcultuur, stroom cytometry en microscopie faciliteiten. Het protocol gebruikt ImageJ of Fiji (een verdeling van ImageJ12), U-track3en enkele ad hoc gemaakt routines (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track en ad hoc routines overreden Matlab die kan worden geïnstalleerd in elke compatibele computer.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven methode is gemakkelijk uit te voeren zelfs zonder enige eerdere ervaring werken met Matlab. Matlab routines echter uiterst nauwkeurigheid met de nomenclatuur van de verschillende opdrachten en de lokalisatie van de verschillende mappen in dienst van het programma. In de tracking routine analyse (stap 3), meerdere parameters kunnen worden gewijzigd. Het venster van “Instelling Gaussiaans-mengsel Model betaamt” (stap 3.8) bepaalt hoe U-track detecteert enkele deeltjes op de video. Dit wordt gedaan door het aa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn Carlo Manzo en Maria García Parajo dankbaar voor hun hulp en source code van de analyse van de coëfficiënt diffusie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het Spaanse ministerie van wetenschap, innovatie en universiteiten (SAF 2017-82940-R) en het RETICS-programma van het Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 en RD16/0012/0006; RIER). LMM en JV worden ondersteund door het programma van de COMFUTURO van de Fundación generaal CSIC.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
References
- Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
- Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
- Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).
