Identificação de fatores nucleolares durante a replicação do HIV-1 através da imunoprecipitação de Rev e espectrometria de massas

Summary

Aqui nós descrevemos a imunoprecipitação do Rev na presença de replicação de HIV-1 para a espectrometria maciça. Os métodos descritos podem ser utilizados para a identificação de fatores nucleolares envolvidos no ciclo infeccioso HIV-1 e são aplicáveis a outros modelos de doenças para a caracterização de vias subestudadas.

Abstract

O ciclo infeccioso HIV-1 requer interações de proteínas virais com fatores hospedeiros para facilitar a replicação viral, embalagem e liberação. O ciclo infeccioso ainda requer a formação de complexos proteicos virais/hospedeiros com RNA HIV-1 para regular a emenda e possibilitar o transporte nucleocitoplasmático. A proteína HIV-1 Rev realiza a exportação nuclear de mRNAs HIV-1 através da multimerização com alvos intrônicos de ação cis-o Rev Response Element (rre). Um sinal de localização nucleolar (NoLS) existe dentro do COOH-Terminus do motivo rico em arginina Rev (ARM), permitindo o acúmulo de complexos de Rev/RRE no nucleolus. Fatores nucleolar são especulados para apoiar o ciclo infeccioso HIV-1 através de várias outras funções, além de mediar a exportação nuclear independente de mRNA e splicing. Nós descrevemos um método do selvagem-tipo (WT) Rev da imunoprecipitação em comparação às mutações nucleolar do Rev (deleção e mutações do único-ponto Rev-NoLS) na presença da replicação de HIV-1 para a espectrometria maciça. Fatores nucleolares implicados no transporte nucleocytoplasmático (nucleophosmin B23 e proteína C23), bem como fatores de emenda celular, perdem a interação com o Rev na presença de mutações do Rev-NOLS. Vários outros fatores nucleolares, como a caixa de snoRNA C/D 58, são identificados para perder a interação com mutações do Rev, mas sua função no ciclo de replicação do HIV-1 permanece desconhecida. Os resultados aqui apresentados demonstram o uso dessa abordagem para a identificação de fatores nucleolares virais/hospedeiros que mantêm o ciclo infeccioso HIV-1. Os conceitos utilizados nesta abordagem são aplicáveis a outros modelos virais e de doenças que exijam a caracterização de vias subestudadas.

Introduction

O nucléolo é postulado como a terra da interação de vários anfitrião celular e fatores virais exigidos para a replicação viral. O nucléolo é uma estrutura complexa subdividida em três compartimentos diferentes: o compartimento fibrilar, o compartimento fibrilar denso, e o compartimento granulado. A proteína HIV-1 Rev localiza-se especificamente dentro de compartimentos granulados; no entanto, a razão para este padrão de localização é desconhecida. Na presença de mutações de ponto único dentro da seqüência de NoLS (mutações do Rev 4, 5, e 6), o Rev mantem um teste padrão nucleolar e foi mostrado previamente para resgatar a replicação do HIV-1_HXB2 , entretanto, com eficiência reduzida comparada ao peso rev¹ . Todas as mutações de ponto único são incapazes de sustentar o ciclo infeccioso HIV-1_NL4-3 . Na presença de múltiplas mutações de ponto único dentro da seqüência de NoLS (mutações do Rev-NoLS 2 e 9), o Rev tem sido observado para dispersar em todo o núcleo e citoplasma e não tem sido capaz de resgatar o HIV-1_HXB2 Replication¹. O objetivo deste estudo do proteômica é decifrar nucleolar assim como fatores celulares nonnucleolar envolvidos no caminho infeccioso HIV-1 mediado por Rev. As condições de imunoprecipitação do Rev são otimizadas através da interação com a fosfoproteína B23 nucleolar, que tem sido mostrada anteriormente para perder a interação com o Rev na presença de mutações nucleolar.

Os fatores celulares do Rev têm sido extensivamente estudados no passado; Entretanto, isto foi feito na ausência de patogénese viral. Uma proteína, em particular, que se caracteriza neste estudo através da interação Rev durante a replicação do HIV-1 é a fosfoproteína nucleolar B23-também chamada nucleophosmin (NPM), numatrina, ou NO38 em anfíbios^{2,3, 4}. B23 é expressado como três isoformas (NPM1, NPM2, e NPM3)-todos os membros da família nuclear de nucleophosmin/nucleoplasmin acompanhante^5,6. A Chaperona molecular NPM1 funciona na montagem adequada de nucleossomas, na formação de complexos de proteínas/ácidos nucleicos envolvidos em estruturas de ordem superior de cromatina^7,8, e na prevenção de agregação e desdobramento de proteínas alvo através de um domínio de núcleo N-terminal (resíduos 1-120)⁹. A funcionalidade NPM1 estende-se à gênese Ribossome através do transporte de partículas preribosomal entre o núcleo e o citoplasma^10,11, o processamento de RNA preribosomal na seqüência ^{interna do espaçador transcrito 12,13}, e prendendo a agregação nucleolar das proteínas durante a montagem ribossomal^14,15. A NPM1 está implicada na inibição da apoptose¹⁶ e na estabilização dos supressores tumorais ARF^17,18 e p53¹⁹, revelando seu duplo papel como fator oncogênico e supressor tumoral. NPM1 participa nas atividades celulares de estabilidade do genoma, replicação centrosome, e transcrição. NPM1 é encontrado nos nucléolos durante a interfase do ciclo de pilha, ao longo da periferia cromossomática durante a mitose, e em corpos prenucleolar (PNB) na conclusão do mitosis. NPM2 e NPM3 não são tão bem estudados quanto NPM1, o que sofre níveis de expressão alterados durante a malignidade²⁰.

NPM1 é documentado no shuttling Mimivírus de várias proteínas nucleares/nucleolar através de um NES interno e de NLS^9,21 e foi relatado previamente para conduzir a importação nuclear de HIV-1 tat e de proteínas do Rev. Na presença de proteínas de fusão B23-Binding-Domain-β-galactosidase, Tat mislocalizes dentro do citoplasma e perde a atividade de transativação; Isso demonstra uma forte afinidade de tat para B23². Outro estudo estabeleceu um complexo estável Rev/B23 na ausência de mRNAs contendo RRE. Na presença de RRE mRNA, o Rev dissocia-se de B23 e liga-se preferivelmente ao HIV RRE, conduzindo ao deslocamento de B23²². Não se sabe onde, no nível subnuclear, a transativação do tat e o processo de troca do Rev de B23 para o HIV mRNA acontecem. Ambas as proteínas são postuladas para entrar no nucléolo simultaneamente através da interação B23. O envolvimento de outras proteínas celulares hospedeiras na via nucleolar do HIV é esperado. Os métodos descritos nesta investigação do proteômica ajudarão a elucidar o interação do nucléolo com os fatores celulares do anfitrião envolvidos durante a patogénese de HIV-1.

A investigação proteômica foi iniciada através da expressão de mutações de ponto único do Rev NoLS (M4, M5 e M6) e múltiplas substituições de arginina (m2 e M9) para a produção de HIV-1_HXB2 . Neste modelo, uma linha celular de HeLa que expressa estàvel a Rev-deficiente HIV-1_HXB2 (hlfb) é transfected com as mutações NUCLEOLAR do peso Rev e do Rev que contêm uma etiqueta da bandeira na extremidade 3 ‘. A presença do WT Rev permitirá a replicação viral ocorrer na cultura do HLfB, em comparação com as mutações do Rev-NoLS que não resgatam a deficiência de Rev (m2 e M9), ou permitem que ocorra replicação viral, mas não tão eficientemente quanto o WT Rev (M4, M5 e M6)¹. O lisado da pilha é coletado 48 h mais tarde após a proliferação viral na presença da expressão do Rev e ser submetido à imunoprecipitação com um tampão do lysis aperfeiçoado para a interação de Rev/B23. A otimização do tampão de Lise usando concentrações de sal variáveis é descrita, e os métodos da eluição da proteína para o Rev do HIV-1 são comparados e analisados em géis prata-manchados ou Coomassie-manchadas da SDS-página. A primeira abordagem proteômica envolve a análise direta de uma amostra eluída de WT Rev, m2, M6 e M9 expressos por espectrometria de massas em tandem. Uma segunda abordagem pela qual os eluatos do WT Rev, M4, M5 e M6 foram submetidos a um processo de extração de gel é comparado com a primeira abordagem. A afinidade peptídica para mutações do Rev-NoLS em comparação ao WT Rev é analisada e a probabilidade de identificação de proteínas é exibida. Essas abordagens revelam potenciais fatores (nucleolar e não nucleolar) que participam do transporte do mRNA do HIV-1 e da emenda com o Rev durante a replicação do HIV-1. Globalmente, as condições de lise celular, IP e eluição descritas são aplicáveis às proteínas virais de interesse para a compreensão dos fatores celulares hospedeiros que ativam e regulam as vias infecciosas. Isso também é aplicável ao estudo de fatores de acolhimento celular necessários para a persistência de vários modelos de doença. Neste modelo proteômica, o HIV-1 Rev IP é otimizado para a interação B23 para elucidar fatores nucleolares envolvidos na atividade de shuttling Mimivírus e na ligação do mRNA do HIV-1. Adicionalmente, linhas celulares que expressam estavelmente modelos de doenças infecciosas que são deficientes para proteínas-chave de interesse podem ser desenvolvidas, semelhante à linha celular HLfB, para estudar as vias infecciosas de interesse.

Protocol

1. cultura celular Manter HLfB no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com o soro bovino fetal de 10% (FBS), o L-Glutamine de 2 milímetros, e o piruvato do sódio de 1 milímetro dentro de placas tecido-cultura-tratadas de 100 milímetros. Mantenha as culturas de células a 37 ° c em uma incubadora humidificada fornecida com 5% de CO2. Células confluentes de passagem para uma densidade celular de 1 x 106 células/ml. Descarte a mídia de cultura de célula….

Representative Results

As mutações de arginina de ponto único e múltiplo do Rev-NoLS, correspondendo a uma variedade de padrões de localização subcelular, foram examinadas em sua capacidade de interagir com fatores hospedeiros celulares em comparação com o WT Rev. WT Rev-3 ‘ Flag e pcDNA-Flag o vetor foi expressado na cultura do HLfB. Os complexos proteicos foram processados do lisado total da pilha e manchados com o reagente de mancha de prata. O Rev-NoLS-3 ‘ Flag é detectável (aproximadamente 18 kDa) em três diferentes c…

Discussion

Análises espectrométricas de massa comparando mutações de Rev-NoLS e WT Rev na presença de HIV-1 foram avaliadas para compreender os fatores nucleolares envolvidos no ciclo de replicação viral. Isto identificaria os componentes nucleolar exigidos para a infectividade viral. Nucleolar B23 tem uma alta afinidade com o Rev-NOLS e funções na localização nucleolar do rev³ e do transporte Mimivírus de mRNAs Rev-Bound do HIV²². A afinidade do B23 com as mutações do R…

Materials

Acetic acid	Fisher Chemical	A38S-212
Acetonitrile	Fisher Chemical	A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide	BioRad	1610158
Ammonium bicarbonate	Fisher Chemical	A643-500
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel	Sigma-Aldrich	A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG	Sigma-Aldrich	F3165
BioMax MS film	Carestream	8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL	Bio-Rad	5000006
B23 mouse monoclonal IgG	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47725
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
Carnation non-fat powdered milk	Nestle	N/A
Cell scraper	ThermoFisher Scientific	179693PK
C18IonKey nanoTile column	Waters	186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes	Fisher Scientific	08-772-22
Dithiothreitol	Thermo Scientific	J1539714
1 x DPBS	Corning	21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate	Pierce	32106
Ethanol, 200 proof	Fisher Chemical	A409-4
FBS	Gibco	16000044
Formic Acid	Fisher Chemical	A117-50
GelCode blue stain reagent	ThermoFisher	24590
Glycerol	Fisher Chemical	56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2005
Iodoacetamide	ACROS Organics	122270050
KimWipe delicate task wiper	Kimberly Clark Professional	34120
L-glutamine	Gibco	25030081
Methanol	Fisher Chemical	67-56-1
NanoAcuity UPLC	Waters	N/A
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Scientific	24600df
15-mL Polypropylene conical tube	Falcon	352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	Thermo Scientific	26616
Protease inhibitor cocktail	Roche	4693132001
Purified BSA	New England Biolabs	B9001
PVDF  Western blotting membrane	Roche	3010040001
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
10 x TBS	Fisher Bioreagents	BP2471500
TEMED	BioRad	1610880edu
Triton X-100 detergent solution	BioRad	1610407
Trizaic source	Waters	N/A
trypsin-EDTA	Corning	25-051-CIS
Tween 20	BioRad	1706531
Synapt G2 mass spectrometer	Waters	N/A
Whatman filter paper	Tisch Scientific	10427813