Rev इम्यूनोवेरिसेशन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से एचआईवी-1 प्रतिकृति के दौरान न्यूक्लिओलर कारकों की पहचान
Summary
यहाँ हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एचआईवी-1 प्रतिकृति की उपस्थिति में रेव इम्यूनोप्रीप्शन का वर्णन करते हैं। वर्णित विधियों एचआईवी-1 संक्रामक चक्र में शामिल न्यूक्लिओलर कारकों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और understudied रास्ते की विशेषता के लिए अन्य रोग मॉडल के लिए लागू होते हैं.
Abstract
एचआईवी-1 संक्रामक चक्र वायरल प्रतिकृति, पैकेजिंग, और रिहाई की सुविधा के लिए मेजबान कारकों के साथ वायरल प्रोटीन बातचीत की आवश्यकता है। संक्रामक चक्र आगे splicing को विनियमित करने और न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक परिवहन को सक्षम करने के लिए एचआईवी-1 आरएनए के साथ वायरल /होस्ट प्रोटीन परिसरों के गठन की आवश्यकता है। एचआईवी-1 रेव प्रोटीन intronic cis-acting लक्ष्य – रेव प्रतिक्रिया तत्व (आरआरई) के साथ multimerization के माध्यम से एचआईवी-1 mRNAs के परमाणु निर्यात को पूरा करता है। एक न्यूक्लिओलर स्थानीयकरण संकेत (NoLS) Rev arginine समृद्ध आकृति (एआरएम) के COOH-टर्मिनस के भीतर मौजूद है, न्यूक्लिओलस में रेव / आर आर ई परिसरों के संचय की अनुमति. न्यूक्लिओलर कारकों MRNA स्वतंत्र परमाणु निर्यात और splicing मध्यस्थता के अलावा विभिन्न अन्य कार्यों के माध्यम से एचआईवी-1 संक्रामक चक्र का समर्थन करने के लिए speculated हैं. हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एचआईवी-1 प्रतिकृति की उपस्थिति में रेव न्यूक्लिओलर उत्परिवर्तनों (हटाने और एकल-बिंदु रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों) की तुलना में जंगली-प्रकार (WT) रेव की एक प्रतिरक्षा विधि का वर्णन करते हैं। न्यूक्लिओलोलर कारकों न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक परिवहन में फंसा (न्यूक्लिओफोस्मिन B23 और न्यूक्लिओलोसिन C23), साथ ही सेलुलर splicing कारकों, रेव-NoLS उत्परिवर्तनों की उपस्थिति में रेव के साथ बातचीत खो देते हैं। विभिन्न अन्य न्यूक्लिओलर कारकों, जैसे snoRNA C/D बॉक्स 58, रेव उत्परिवर्तनों के साथ बातचीत खोने के लिए पहचाने जाते हैं, फिर भी एचआईवी-1 प्रतिकृति चक्र में उनके कार्य अज्ञात रहते हैं। यहाँ प्रस्तुत परिणाम वायरल / मेजबान न्यूक्लिओलर कारकों की पहचान के लिए इस दृष्टिकोण के उपयोग को प्रदर्शित करता है जो एचआईवी-1 संक्रामक चक्र को बनाए रखते हैं। इस दृष्टिकोण में इस्तेमाल अवधारणाओं अन्य वायरल और रोग मॉडल understudied रास्ते की विशेषता की आवश्यकता के लिए लागू होते हैं.
Introduction
न्यूक्लिओलस विभिन्न सेलुलर मेजबान और वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक वायरल कारकों की बातचीत जमीन के रूप में अभिगृहीत है. न्यूक्लिओलस एक जटिल संरचना है जो तीन अलग-अलग डिब्बों में विभाजित है: फिब्रिलर डिब्बे, घने फिब्रिलर डिब्बे, और दानेदार डिब्बे। एचआईवी-1 रेव प्रोटीन विशेष रूप से दानेदार डिब्बों के भीतर स्थानीयकृत; हालांकि, इस स्थानीयकरण पैटर्न के लिए कारण अज्ञात है। NoLS अनुक्रम के भीतर एकल बिंदु उत्परिवर्तनों की उपस्थिति में (रेव उत्परिवर्तनों 4, 5, और 6), रेव एक न्यूक्लिओलर पैटर्न बनाए रखता है और पहले एचआईवी-1HXB2 प्रतिकृति बचाव के लिए दिखाया गया है, तथापि, कम दक्षता के साथ WT Rev 1 की तुलना में . सभी एकल बिंदु उत्परिवर्तन एचआईवी-1NL4-3 संक्रामक चक्र को बनाए रखने में असमर्थ हैं। NoLS अनुक्रम के भीतर कई एकल बिंदु उत्परिवर्तनों की उपस्थिति में (Rev-NoLS उत्परिवर्तन 2 और 9), रेव नाभिक और कोशिका द्रव्य भर में फैलाने के लिए मनाया गया है और एचआईवी-1HXB2 प्रतिकृति1बचाव करने में सक्षम नहीं किया गया है. इस प्रोटीओमिक्स अध्ययन का लक्ष्य न्यूक्लिओलर के साथ-साथ रेव-मध्यस्थ एचआईवी-1 संक्रामक मार्ग में शामिल गैर-न्यूक्लिओलर सेलुलर कारकों को समझने के लिए है। Rev प्रतिरक्षा की स्थिति न्यूक्लिओलर B23 फॉस्फोप्रोटीन, जो पहले न्यूक्लिओलर उत्परिवर्तनों की उपस्थिति में रेव के साथ बातचीत खोने के लिए दिखाया गया है के साथ बातचीत के माध्यम से अनुकूलित कर रहे हैं.
रेव सेलुलर कारकों बड़े पैमाने पर अतीत में अध्ययन किया गया है; हालांकि, यह वायरल रोगजनन की अनुपस्थिति में किया गया है। एक प्रोटीन, विशेष रूप से, कि एचआईवी-1 प्रतिकृति के दौरान रेव बातचीत के माध्यम से इस अध्ययन में विशेषता है न्यूक्लिओलर फॉस्फोप्रोटीन B23 – भी न्यूक्लिओफोफॉस्मिन (एनपीएम), numatrin, या उभयचर2मेंNO38 कहा जाता है ,3, 4. बी 23 को तीन समरूपों (एनपीएम1, एनपीएम2, और एनपीएम3) के रूप में व्यक्त किया जाता है – न्यूक्लिओफोस्मिन/न्यूक्लिओप्लास्मिन न्यूक्लियर चैपरोन परिवार5,6के सभी सदस्य । NPM1 आणविक chaperone न्यूक्लिओसोम की उचित विधानसभा में कार्य करता है, क्रोमैटिन उच्च क्रम संरचनाओं में शामिल प्रोटीन / न्यूक्लिक एसिड परिसरों के गठन में7,8, और एकत्रीकरण की रोकथाम में और एन-टर्मिनल कोर डोमेन (अवशेष 1-120)9के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीनों का गलत उपयोग करना। NPM1 कार्यक्षमता नाभिक और कोशिकाद्रव्य10,11के बीच preribosomal कणों के परिवहन के माध्यम से राइबोसोम उत्पत्ति तक फैली हुई है , आंतरिक प्रतिलेखन स्पेसर अनुक्रम में preribosomal आरएनए के प्रसंस्करण 12,13, और रिबोसोमल सभा14,15के दौरान प्रोटीनों के न्यूक्लिओलर एकत्रीकरण को गिरफ्तार करना . NPM1 apoptosis के निषेध में फंसा हुआ है16 और ट्यूमर suppressors ARF17,18 और p5319के स्थिरीकरण में , एक oncogenic कारक और ट्यूमर दबानेवाला के रूप में अपनी दोहरी भूमिका का खुलासा. NPM1 जीनोम स्थिरता, सेन्ट्रोसोम प्रतिकृति, और प्रतिलेखन के सेलुलर गतिविधियों में भाग लेता है. एनपीएम1 कोशिका चक्र अंतराल के दौरान न्यूक्लिओली में पाया जाता है, माइटोसिस के दौरान गुणसूत्र परिधि के साथ, और मिटोसिस के समापन पर प्रीन्यूक्लिओलर निकायों (पीएनबी) में पाया जाता है। NPM2 और NPM3 के रूप में अच्छी तरह से NPM1 के रूप में अध्ययन नहीं कर रहे हैं, जो द्रोह20के दौरान बदल अभिव्यक्ति के स्तर से गुजरना .
NPM1 एक आंतरिक NES और NLS9,21 के माध्यम से विभिन्न परमाणु /न्यूक्लिओलर प्रोटीन के न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक बंद करने में प्रलेखित किया गया है और पहले एचआईवी-1 टाट और रेव प्रोटीन के परमाणु आयात ड्राइव करने के लिए सूचित किया गया था। B23-binding-domain-]-galactosidase संलयन प्रोटीन की उपस्थिति में, Tat cytoplasm के भीतर mislocalizes और transactivation गतिविधि खो देता है; यह B232के लिए Tat की एक मजबूत संबंध को दर्शाता है . एक अन्य अध्ययन ने आरआरई युक्त एमआरनए के अभाव में एक रेव/बी 23 स्थिर परिसर की स्थापना की। RRE MRNA की उपस्थिति में, रेव B23 से अलग है और बेहतर एचआईवी RRE के लिए बांध, B2322के विस्थापन के लिए अग्रणी. यह अज्ञात है, जहां, उप-परमाणु स्तर पर, टैट ट्रांसएक्टिवेशन और एचआईवी एमआरएनए के लिए बी 23 की रेव विनिमय प्रक्रिया होती है। दोनों प्रोटीन ों को बी23 अन्योन्यक्रिया के माध्यम से एक साथ न्यूक्लिओलस में प्रवेश करने के लिए अभिगृहीत किया जाता है। एचआईवी न्यूक्लिओलर मार्ग में अन्य मेजबान सेलुलर प्रोटीन की भागीदारी की संभावना है। इस प्रोटीओमिक्स जांच में वर्णित विधियों से एचआईवी-1 रोगजनन के दौरान शामिल मेजबान सेलुलर कारकों के साथ न्यूक्लिओलस की परस्पर क्रिया को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी।
प्रोटीओमिक्स जांच एचआईवी-1HXB2 उत्पादन के लिए रेव नोल्स एकल-बिंदु उत्परिवर्तनों (एम 4, एम 5, और एम 6) और कई आर्जिनिन प्रतिस्थापन (एम 2 और एम 9) की अभिव्यक्ति के माध्यम से शुरू की गई थी। इस मॉडल में, एक HeLa सेल लाइन stably Rev-1HXB2 (HLfB) व्यक्त WT रेव और Rev न्यूक्लिओलर उत्परिवर्तनों 3 ‘अंत में एक झंडा टैग युक्त के साथ transfected है. WT Rev की उपस्थिति वायरल प्रतिकृति HLfB संस्कृति में होने की अनुमति देगा, Rev-NoLS उत्परिवर्तनों कि रेव की कमी बचाव नहीं है की तुलना में (M2 और M9), या वायरल प्रतिकृति होने की अनुमति नहीं है, लेकिन के रूप में कुशलता से नहीं के रूप में WT Rev (M4, M5, और M6)1. सेल lysate 48 एच बाद में रेव अभिव्यक्ति की उपस्थिति में वायरल प्रसार के बाद एकत्र किया जाता है और Rev/B23 बातचीत के लिए अनुकूलित एक lysis बफर के साथ इम्यूनोप्रीसेंस के अधीन है। Lysis बफर अनुकूलन अलग नमक सांद्रता का उपयोग कर वर्णित है, और एचआईवी-1 रेव के लिए प्रोटीन elution तरीकों की तुलना में कर रहे हैं और चांदी से सना हुआ या Coomassi दाग एसडीएस-पेज जैल में विश्लेषण किया. पहले proteomics दृष्टिकोण व्यक्त WT रेव, M2, M6, और M9 अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा से एक eluted नमूना का प्रत्यक्ष विश्लेषण शामिल है. एक दूसरा दृष्टिकोण जिसके द्वारा WT Rev, M4, M5, और M6 के eluates एक जेल निष्कर्षण प्रक्रिया पहले दृष्टिकोण की तुलना में है. WT Rev की तुलना में रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों के लिए पेप्टाइड आत्मीयता का विश्लेषण किया जाता है और प्रोटीन पहचान संभावना प्रदर्शित की जाती है। इन दृष्टिकोणों से संभावित कारकों (न्यूक्लिओलर और nonnucleolar) प्रकट होते हैं जो एचआईवी-1 एमआरएनए परिवहन में भाग लेते हैं और एचआईवी-1 प्रतिकृति के दौरान रेव के साथ splicing करते हैं। कुल मिलाकर, सेल lysis, आईपी, और elution शर्तों वर्णित मेजबान सेलुलर कारकों है कि सक्रिय करने और संक्रामक रास्ते को विनियमित की समझ के लिए ब्याज की वायरल प्रोटीन के लिए लागू होते हैं. यह भी सेलुलर मेजबान विभिन्न रोग मॉडल के हठ के लिए आवश्यक कारकों के अध्ययन के लिए लागू है. इस प्रोटीओमिक्स मॉडल में, एचआईवी-1 रेव आईपी को बी 23 इंटरैक्शन के लिए अनुकूलित किया जाता है ताकि न्यूक्लिओलर कारकों को स्पष्ट किया जा सके जो न्यूक्लिओटोप्लाज्मिक शटलिंग गतिविधि और एचआईवी-1 एमआरएनए बाइंडिंग में शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, सेल लाइनों stably संक्रामक रोग मॉडल है कि ब्याज की प्रमुख प्रोटीन के लिए कमी कर रहे हैं व्यक्त विकसित किया जा सकता है, HLfB सेल लाइन के समान, ब्याज के संक्रामक रास्ते का अध्ययन करने के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
एचआईवी-1 की उपस्थिति में रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों और डब्ल्यूटी रेव की तुलना करने वाले मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण वायरल प्रतिकृति चक्र में शामिल न्यूक्लिओलर कारकों को समझने के लिए मूल्यांकन किए ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH) एड्स अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक कार्यक्रम, एड्स के प्रभाग, एलर्जी और संक्रामक संस्थान द्वारा प्रदान की HLfB अनुयायी संस्कृति के लिए डॉ बारबरा के Felber और डॉ जॉर्ज एन Pavlakis स्वीकार करते हैं रोग (एनआईएआईडी), एनआईएच। लेखक भी NIH, अनुदान AI042552 और AI029329 द्वारा प्रदान की वित्तीय स्रोतों को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-212 | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Acrylamide:Bisacrylamide | BioRad | 1610158 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Chemical | A643-500 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| ANTI-Flag M2 affinity gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| BioMax MS film | Carestream | 8294985 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL | Bio-Rad | 5000006 | |
| B23 mouse monoclonal IgG | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47725 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carnation non-fat powdered milk | Nestle | N/A | |
| Cell scraper | ThermoFisher Scientific | 179693PK | |
| C18IonKey nanoTile column | Waters | 186003763 | |
| Corning 100-mm TC-treated culture dishes | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Dithiothreitol | Thermo Scientific | J1539714 | |
| 1 x DPBS | Corning | 21-030-CVRS | |
| ECL Estern blotting substrate | Pierce | 32106 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Chemical | A409-4 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GelCode blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | |
| goat-anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2005 | |
| Iodoacetamide | ACROS Organics | 122270050 | |
| KimWipe delicate task wiper | Kimberly Clark Professional | 34120 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| NanoAcuity UPLC | Waters | N/A | |
| Pierce Silver Stain Kit | Thermo Scientific | 24600df | |
| 15-mL Polypropylene conical tube | Falcon | 352097 | |
| Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Scientific | 26616 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | |
| Purified BSA | New England Biolabs | B9001 | |
| PVDF Western blotting membrane | Roche | 3010040001 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| 10 x TBS | Fisher Bioreagents | BP2471500 | |
| TEMED | BioRad | 1610880edu | |
| Triton X-100 detergent solution | BioRad | 1610407 | |
| Trizaic source | Waters | N/A | |
| trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CIS | |
| Tween 20 | BioRad | 1706531 | |
| Synapt G2 mass spectrometer | Waters | N/A | |
| Whatman filter paper | Tisch Scientific | 10427813 |
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