Идентификация нуклеолярных факторов во время репликации ВИЧ-1 через Rev Immunoprecipitation и масс-спектрометрию
Summary
Здесь мы описываем Rev иммунопрецитивность в присутствии ВИЧ-1 репликации для масс-спектрометрии. Описанные методы могут быть использованы для выявления нуклеолярных факторов, участвующих в инфекционном цикле ВИЧ-1, и применимы к другим моделям заболеваний для характеристики недостаточно изученных путей.
Abstract
Инфекционный цикл ВИЧ-1 требует взаимодействия вирусного белка с принимающими факторами для облегчения репликации вируса, упаковки и высвобождения. Инфекционный цикл далее требует формирования вирусных/хостовых белковых комплексов с РНК ВИЧ-1 для регулирования сращивания и обеспечения нуклеоцитоплазмического переноса. Белок ВИЧ-1 Rev выполняет ядерный экспорт ВИЧ-1 мРНК за счет мультимеризации с интроническими целями cis– элементом rev response (RRE). Сигнал локализации ядра (NoLS) существует в пределах COOH-термина мотива Rev аргинина (ARM), что позволяет накапливать комплексы Rev/RRE в ядре. Нуклеолярные факторы предполагают, чтобы поддержать ВИЧ-1 инфекционный цикл через различные другие функции в дополнение к посредничеству мРНК-независимых ядерных экспорта и сплайсинга. Мы описываем метод иммунопреципиции дикого типа (WT) Rev по сравнению с ревнулопатическими мутациями (удаление и одноточечные мутации Rev-NoLS) при наличии репликации ВИЧ-1 для массовой спектрометрии. Нуклеолярные факторы, замешанные в нуклеотипласмичном переносе (нуклеофосмимин B23 и нуклеолин C23), а также клеточные факторы сплайсинга, теряют взаимодействие с Rev в присутствии мутаций Rev-NoLS. Различные другие нуклеолярные факторы, такие как snoRNA C/D box 58, идентифицируются, чтобы потерять взаимодействие с мутациями Rev, но их функция в цикле репликации ВИЧ-1 остается неизвестной. Представленные здесь результаты свидетельствуют об использовании этого подхода для выявления вирусных/хост-нуклеолярных факторов, поддерживающих инфекционный цикл ВИЧ-1. Концепции, используемые в этом подходе, применимы к другим вирусным моделям и моделям заболеваний, требующим характеристики недостаточно изученных путей.
Introduction
Ядро постулируется как место взаимодействия различных клеточных хостов и вирусных факторов, необходимых для репликации вируса. Ядро представляет собой сложную структуру, разделенную на три различных отсека: фибриллярный отсек, плотный фибриллярный отсек и гранулированный отсек. Белок ВИЧ-1 Rev локализуется специально в гранулированных отсеках; однако причина такой схемы локализации неизвестна. При наличии одноточечных мутаций в последовательности NoLS (Rev мутации 4, 5 и 6), Rev поддерживает нуклеолярную модель и ранее было показано, чтобы спасти ВИЧ-1HXB2 репликации, однако, с пониженной эффективностью по сравнению с WT Rev1 . Все одноточечные мутации не в состоянии поддерживать инфекционный цикл ВИЧ-1NL4-3. При наличии нескольких одноточечных мутаций в последовательности NoLS (Rev-NoLS мутации 2 и 9), Rev наблюдается разойтись по всему ядру и цитоплазмы и не смог спасти ВИЧ-1HXB2 репликации1. Цель этого исследования протеомики заключается в расшифровке нуклеолярных, а также ненуклеолярных клеточных факторов, участвующих в инфекционном пути, опосредоваваемом ВИЧ-1. Условия иммунопреципатации оптимизированы при взаимодействии с нуклеолярным фосфопротеим B23, который ранее был показан, чтобы потерять взаимодействие с Rev в присутствии нуклеолярных мутаций.
Rev клеточных факторов были широко изучены в прошлом; однако это было сделано при отсутствии вирусного патогенеза. Один белок, в частности, что характеризуется в этом исследовании через Rev взаимодействия во время репликации ВИЧ-1 является нуклеолярный фосфопротеин B23 – также называемый нуклеофосмиин (NPM), numatrin, или NO38 в амфибий2,3, 4. B23 выражается как три изоформы (NPM1, NPM2, и NPM3) – все члены нуклеофосмина / нуклеоплазмина ядерного сопровождающего семейства5,6. Молекулярный сопровождающий NPM1 функционирует при надлежащей сборке нуклеосом, в формировании белково-нуклеиновых кислотных комплексов, участвующих в структурах высшего порядка хроматина7,8,и в профилактике агрегации и неправильное сворачивание целевых белков через n-терминальный ядерный домен (остатки 1-120)9. Функциональность NPM1 распространяется на рибосомный генезис через транспортировку прерибосомных частиц между ядром и цитоплазмой10,11, обработка прейбосомальной РНК во внутренней транскрибированной последовательности прокладки 12,13, и арест нуклеолярной агрегации белков во время рибосомной сборки14,15. NPM1 вовлечен в ингибирование апоптоза16 и в стабилизацию опухолевых супрессоров ARF17,18 и p5319,раскрывая свою двойную роль в качестве онкогенного фактора и супрессора опухоли. NPM1 участвует в клеточной деятельности стабильности генома, центросомного репликации и транскрипции. NPM1 содержится в нуклеоли во время межфазы клеточного цикла, вдоль хромосомной периферии во время митоза, и в пренуклеолярных телах (PNB) при заключении митоза. NPM2 и NPM3 не так хорошо изучены, как NPM1, который подвергается изменению уровня экспрессии при злокачественности20.
NPM1 документируется в нуклеоцитоплазматических челночных различных ядерных / нуклеолярных белков через внутренние РЭШ и NLS9,21 и ранее сообщалось, чтобы диск ядерного импорта ВИЧ-1 Тат и Rev белков. В присутствии B23-связывающего домена-я-галактосидазных термоядерных белков, Тат неправильно локализует в цитоплазме и теряет трансактивационную активность; это демонстрирует сильную близость Тат для B232. Другое исследование установило Rev/B23 стабильный комплекс в отсутствие RRE-содержащих мРНК. В присутствии RRE mRNA, Rev отделяется от B23 и связывает предпочтительно к ВИЧ RRE, что приводит к смещению B2322. Неизвестно, где на субядерном уровне происходит Таттрансактивация и процесс обмена В23 на ВИЧ-мРНК. Оба белка постулируются для ввода ядра одновременно через Взаимодействие B23. Ожидается вовлечение других клеточных белков хозяина в нуклеолярный путь ВИЧ. Методы, описанные в этом исследовании протеомики, помогут выяснить взаимодействие ядра с клеточными факторами хозяина, участвующими во время патогенеза ВИЧ-1.
Исследование протеомики было начато с помощью выражения одноточественных мутаций Rev NoLS (M4, M5 и M6) и нескольких замен аргинина (M2 и M9) для производства ВИЧ-1HXB2. В этой модели, HeLa клеточной линии устойчиво выражая Rev-дефицитНЫХ ВИЧ-1HXB2 (HLfB) трансфицируется WT Rev и Rev нуклеолярных мутаций, содержащих тег флага в 3’end. Присутствие WT Rev позволит вирусной репликации происходит в культуре HLfB, по сравнению с Rev-NoLS мутаций, которые не спасти Rev дефицита (M2 и M9), или позволяют вирусной репликации происходит, но не так эффективно, как WT Rev (M4, M5, и M6)1. Лизат клетки собран 48 h более поздно после вирусного пролиферации в присутствии выражения Rev и подвергся к immunoprecipitation с буфером lysis оптимизированным для взаимодействия Rev/B23. Описывается оптимизация буфера лизиса с использованием различных концентраций соли, а методы элюционизации белка для ВИЧ-1 Rev сравниваются и анализируются в окрашенных серебром или комасси-окрашенных гелях SDS-PAGE. Первый подход протеомики включает в себя прямой анализ элетативной выборки из выраженных WT Rev, M2, M6 и M9 тандемной масс-спектрометрией. Второй подход, при котором улеты WT Rev, M4, M5 и M6 прошли процесс извлечения геля, сравнивается с первым подходом. Пептид сродство к Rev-NoLS мутаций по сравнению с WT Rev анализируется и вероятность идентификации белка отображается. Эти подходы выявляют потенциальные факторы (нуклеолярные и ненуклеолярные), которые участвуют в транспортировке ВИЧ-1 мРНК и сращивания с Rev во время репликации ВИЧ-1. В целом, описанные условия клеточного лиза, ИС и элуции применимы к вирусным белкам, представляющим интерес для понимания клеточных факторов хозяина, которые активируют и регулируют инфекционные пути. Это также применимо к изучению клеточных факторов хозяина, необходимых для сохранения различных моделей заболеваний. В этой модели протеомики, ВИЧ-1 Rev IP оптимизирован для взаимодействия B23 для выяснения нуклеолярных факторов, участвующих в нуклеотипитопасмической челночной деятельности и связывания ВИЧ-1 мРНК. Кроме того, можно разработать клеточные линии, четко выражающие модели инфекционных заболеваний, которые не достаточны для ключевых белков, представляющих интерес, подобно линии клеток HLfB, для изучения инфекционных путей, представляющих интерес.
Protocol
Representative Results
Discussion
Масс-спектрометрические анализы, сравнивающие мутации Rev-NoLS и WT Rev в присутствии ВИЧ-1, были оценены для понимания нуклеолярных факторов, участвующих в цикле репликации вирусов. Это позволит определить нуклеолярные компоненты, необходимые для вирусной инфекции. Нуклеоляр B23 имеет высок?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают д-р Барбара К. Фелбер и д-р Джордж Н. Павлакис для HLfB приверженцев культуры, предоставляемые Национальными институтами здравоохранения (NIH) СПИД исследований и справочных реагентов программы, Отдел СПИДа, Национальный институт аллергии и инфекционных болезни (НИАИД), NIH. Авторы также признают финансовые источники, предоставленные NIH, Grants AI042552 и AI029329.
Materials
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-212 | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Acrylamide:Bisacrylamide | BioRad | 1610158 | |
| Ammonium bicarbonate | Fisher Chemical | A643-500 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| ANTI-Flag M2 affinity gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| BioMax MS film | Carestream | 8294985 | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL | Bio-Rad | 5000006 | |
| B23 mouse monoclonal IgG | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47725 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carnation non-fat powdered milk | Nestle | N/A | |
| Cell scraper | ThermoFisher Scientific | 179693PK | |
| C18IonKey nanoTile column | Waters | 186003763 | |
| Corning 100-mm TC-treated culture dishes | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Dithiothreitol | Thermo Scientific | J1539714 | |
| 1 x DPBS | Corning | 21-030-CVRS | |
| ECL Estern blotting substrate | Pierce | 32106 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Chemical | A409-4 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GelCode blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | |
| Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | |
| goat-anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2005 | |
| Iodoacetamide | ACROS Organics | 122270050 | |
| KimWipe delicate task wiper | Kimberly Clark Professional | 34120 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| NanoAcuity UPLC | Waters | N/A | |
| Pierce Silver Stain Kit | Thermo Scientific | 24600df | |
| 15-mL Polypropylene conical tube | Falcon | 352097 | |
| Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Scientific | 26616 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | |
| Purified BSA | New England Biolabs | B9001 | |
| PVDF Western blotting membrane | Roche | 3010040001 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| 10 x TBS | Fisher Bioreagents | BP2471500 | |
| TEMED | BioRad | 1610880edu | |
| Triton X-100 detergent solution | BioRad | 1610407 | |
| Trizaic source | Waters | N/A | |
| trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CIS | |
| Tween 20 | BioRad | 1706531 | |
| Synapt G2 mass spectrometer | Waters | N/A | |
| Whatman filter paper | Tisch Scientific | 10427813 |
References
- Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
- Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
- Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochimie. 36, 3941-3949 (1997).
- Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
- Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Génétique. 173, 1835-1850 (2006).
- Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
- Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
- Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
- Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
- Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
- Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
- Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
- Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
- Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
- Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
- Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
- Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
- Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
- Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
- Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
- Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
- Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
- Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
- Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
- Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
- Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochimie. 34, 8037-8042 (1995).
- Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
- Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
- Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
- Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
- Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
- Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
- Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).
