Capacidade de diferenciação de células progenitoras de aorta humana Perivascular adiposo
Summary
O objetivo do presente protocolo é testar a capacidade de células progenitoras derivadas de tecido adiposo de perivascular humana de se diferenciar em várias linhagens de célula. Diferenciação foi comparada com as células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea humana, que é conhecida por se diferenciar em adipócitos, osteócito e linhagens de condrócitos.
Abstract
Tecido adiposo é uma fonte rica de multi potentes tronco células mesenquimais (MSC) capazes de diferenciar em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic. Adipogenic diferenciação de células progenitoras é um mecanismo importante conduzir a expansão do tecido adiposo e disfunção em resposta à obesidade. Mudanças de entendimento para o tecido adiposo de perivascular (PVAT) é, portanto, clinicamente relevantes na doença metabólica. No entanto, estudos anteriores têm sido predominantemente realizada em mouse e outro animal modelos. Este protocolo usa humana torácica PVAT amostras coletadas de pacientes submetidos à cirurgia de enxerto de bypass de artéria coronária. Tecido adiposo da aorta ascendente foi recolhido e utilizado para explantação da fração vascular do estroma. Anteriormente confirmamos a presença de células adiposas reprodutoras em PVAT humana com a capacidade de se diferenciarem em lipídios contendo adipócitos. Neste estudo, mais analisamos o potencial de diferenciação das células da fracção do estroma vascular, presumivelmente, contendo células progenitoras multi potente. Nós comparamos PVAT-derivado de células de medula óssea humana MSC para diferenciação em adipogenic, osteogênica e linhagens de chondrogenic. Após 14 dias de diferenciação, manchas específicas foram utilizadas para detectar o acúmulo de lipídios nos adipócitos (O óleo vermelho), calcificar depósitos em células osteogênicas (vermelho de alizarina), ou glicosaminoglicanos e colagénio nas células chondrogenic (Trichrome de Masson). Enquanto a medula óssea MSC eficientemente diferenciada em todas as três linhagens, PVAT-derivado de células tinham adipogenic e chondrogenic potencial, mas faltava-lhe potencial osteogênico robusto.
Introduction
Tecido adiposo é uma fonte rica de multi potentes tronco células mesenquimais (MSC) capazes de diferenciar em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic1. Este tecido se expande através da hipertrofia dos adipócitos maduros e de diferenciação de novo de MSC residente de adipócitos. Tecido adiposo de perivascular (PVAT) envolve os vasos sanguíneos e regula a função vascular2,3. Expansão de PVAT induzida pela obesidade exacerba patologias cardiovasculares. Enquanto o potencial multipotent de MSC de depósitos de tecido adiposos subcutâneos humanos têm sido bem estudadas4,5, nenhum estudo tem explantados e avaliada a capacidade de diferenciação das células progenitoras humano PVAT-derivado, provavelmente devido a a invasividade dos contratos. Assim, o objetivo deste trabalho é fornecer uma metodologia de explantes e propagar as células progenitoras de PVAT aórtica humana de pacientes com doença cardiovascular e testar a sua propensão para diferenciar a osteogênica, chondrogenic e adipogenic linhagens. Nossa fonte de PVAT é do local da anastomose do enxerto desvio na crescente aorta de pacientes obesos submetidos à cirurgia de enxerto de bypass de artéria coronária. PVAT recentemente isolado é enzimaticamente dissociada e a fração do estroma vascular é isolada e propagada in vitro, permitindo-nos testar, pela primeira vez, a capacidade de diferenciação de células progenitoras derivadas PVAT humana.
Usando principal culto humano PVAT do estroma vascular fração, testamos três ensaios projetados para induzir células tronco/progenitoras para diferenciar em direção adipogenic, osteogênica, ou linhagens chondrogenic. Nosso estudo prévio identificou uma população de CD73 + CD105 + e células PDGFRa + (CD140a) que podem verdadeiramente diferenciar em adipócitos6, apesar de sua multipotency não foi testado. PVAT regula diretamente de Tom e inflamação vascular7. A justificativa para testar o potencial de diferenciação dessa população celular novela é para começar a entender a influência especializada de PVAT na função vascular e mecanismos de expansão PVAT durante a obesidade. Esta metodologia melhora o nosso entendimento das funções das células progenitoras derivadas de tecido adiposo e nos permite identificar e comparar as semelhanças e diferenças de células progenitoras de fontes diferentes de tecido. Nós construímos abordagens estabelecidos e validados para isolar e diferenciando MSC no sentido de diferentes linhagens e otimizar procedimentos para maximizar a viabilidade de células progenitoras derivadas PVAT humana. Estas técnicas têm aplicações amplas nos campos da haste e progenitoras célula pesquisa e tecido adiposo desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Células progenitoras adiposa de diferentes depósitos variam amplamente no fenótipo e diferenciação potencial9. Cultivo de progenitores PVAT-derivado de um único doador paciente na indução simultânea para baixo três linhagens diferentes, adipogenic, osteogênica e chondrogenic, permite uma investigação bem controlada da capacidade deste romance pluripotentes população de células progenitoras. A metodologia descrita neste relatório pode ser usada para testar a capacidade de diferenci…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos a assistência de navegação de pesquisa no Maine Medical Center para assistir com a aquisição de tecido clínico, histopatologia e Histomorfometria Core (apoiada pela 1P20GM121301, L. Liaw PI) em Maine Medical Center Research Instituto de corte e coloração. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder R01 HL141149 (L. Liaw).
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
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