人主动脉周脂肪祖细胞的分化能力
Summary
该方案的目的是测试从人类血管周围脂肪组织衍生的祖细胞分化为多个细胞谱系的能力。将分化与人骨髓间充质干细胞进行了比较, 骨髓间充质干细胞被认为分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞谱系。
Abstract
脂肪组织是多功能间充质干细胞 (msc) 的丰富来源, 能够分化为成骨、脂肪生成和软骨生谱系。祖细胞的脂肪分化是推动脂肪组织扩张和肥胖功能障碍的主要机制。因此, 了解血管周围脂肪组织 (pvat) 的变化在临床上与代谢疾病有关。然而, 以前的研究主要是在老鼠和其他动物模型中进行的。该方案使用从冠状动脉旁路移植术患者中采集的人体胸腔 pvat 样本。从上升主动脉收集脂肪组织, 用于解释间质血管部分。我们先前证实了脂肪祖细胞在人 pvat 中的存在, 有能力分化为含有脂质的脂肪细胞。在这项研究中, 我们进一步分析了细胞从基质血管部分的分化潜力, 大概包含多能祖细胞。我们比较了 pvat 衍生细胞与人骨髓 msc 的分化, 分为脂原、成骨和软骨源谱系。经过14天的分化, 特定的污渍被用来检测脂肪细胞 (油红色 o) 的脂质积累, 成骨细胞 (alizarin 红) 的钙沉积, 或糖胺多糖和软骨细胞的胶原蛋白 (马松的三丁目)。骨髓 msc 有效地分化为所有三个谱系, pv 衍生细胞具有脂原和软骨生成的潜力, 但缺乏强大的成骨潜力。
Introduction
脂肪组织是多功能间充质干细胞 (msc) 的丰富来源, 能够分化为成骨、脂肪生成和软骨生谱系 1。该组织通过成熟脂肪细胞的肥大和常驻 msc 向脂肪细胞的新分化而扩张。血管周围脂肪组织 (pvat) 包围血管, 调节血管功能2,3。肥胖引起的 pvat 扩张加剧了心血管疾病。虽然人类皮下脂肪库中 msc 的多能潜力已经得到了 4,5的很好的研究, 但没有任何研究解释和评价人 pv 衍生祖细胞的分化能力, 这可能是由于采购的侵入性。因此, 这项工作的目的是提供一种方法, 以外植体和繁殖祖细胞从人主动脉 pvat 从心血管疾病患者, 并测试他们的倾向, 以分化为成骨性, 软骨原生, 和脂原系。我们的 pvat 来源来自正在接受冠状动脉旁路移植手术的肥胖患者主动脉上旁路移植术吻合部位。新鲜分离的 pvat 是酶样离解和间质血管部分在体外分离和繁殖, 使我们能够首次检测人 pvat 衍生祖细胞的分化能力。
我们使用原代培养的人 pvat 基质血管部分, 我们测试了三种检测方法, 旨在诱导干细胞祖细胞分化为脂肪原、成骨或软骨生谱系。我们先前的研究确定了 cd73 +、cd105 + 和 pdgfra + (cd140a) 细胞的数量, 这些细胞可以有力地分化为脂肪细胞6,尽管它们的多效力没有经过测试。pvat 直接调节血管张力和炎症7。测试这种新型细胞群体分化潜力的基本原理是开始了解 pvat 对血管功能的特殊影响, 以及 pvat 在肥胖期间扩张的机制。这种方法增强了我们对脂肪组织衍生祖细胞功能的理解, 使我们能够识别和比较来自不同组织来源的祖细胞的异同。我们建立在既定和经过验证的方法, 以分离和区分 msc 对不同的血统和优化程序, 以最大限度地提高人类 pv 衍生祖细胞的生存能力。这些技术在干细胞和祖细胞研究和脂肪组织发育领域有着广泛的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
不同仓库的脂肪祖细胞在表型和分化潜力上差异很大。从单个患者捐献者身上培养 pvat 衍生的祖细胞, 同时诱导出三个不同的谱系, 即脂原体、成骨和软骨遗传, 可以对这款小说的多能能力进行控制性的研究祖细胞的数量。本报告中描述的方法可用于检测人 pvat 祖细胞的分化能力, 并了解其在调节 pvat 病理和血管张力方面的作用。这项技术的一些好处是它的简单性和使用的原发性?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢缅因州医学中心研究导航在协助临床组织采购方面的协助, 以及缅因州医学中心研究中心的组织病理学和组织形态测量核心 (由 1p20gm121301, l. liaw pi 提供支持)用于切片和染色的研究所。这项工作得到了国家卫生研究院 r01 hl141149 (l. liaw) 赠款的支持。
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
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