Differentiering kapacitet af menneskelige aorta Perivascular fedt stamceller
Summary
Målet med denne protokol er at teste stamceller afledt af menneskelige perivascular fedtvæv evne til at differentiere i flere celle lineages. Differentiering sammenlignet med mesenkymale stamceller fra menneskelige knoglemarven, som er kendt for at differentiere sig til adipocyt, osteocyte og Chondrocyt lineages er afledt.
Abstract
Fedtvæv er en rig kilde af multi potent mesenchymale stamceller (MSC) i stand til at differentiere i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic slægter. Adipogenic differentieringen af stamceller er en vigtig mekanisme kørsel fedtvæv ekspansion og dysfunktion i svar til fedme. Forståelse ændringer til perivascular fedtvæv (PVAT) er således klinisk relevant i metabolisk sygdom. Tidligere undersøgelser har dog været overvejende udføres i musen og andre dyre modeller. Denne protokol bruger menneskelige thorax PVAT prøver indsamlet fra patienter, der gennemgår koronararterie bypass graft operation. Fedtvæv fra den opstigende aorta blev indsamlet og brugt til explantation af det stromale vaskulære brøkdel. Vi har tidligere bekræftet tilstedeværelsen af adipøst stamceller i menneskelige PVAT med kapacitet til at differentiere i lipid-holdige adipocytter. I denne undersøgelse analyseret vi yderligere differentiering potentiale af celler fra de stromale vaskulære fraktion, der formentlig indeholder flere potent stamceller. Vi sammenlignet PVAT-afledte celler til menneskelig knoglemarv MSC for differentiering af adipogenic, osteogenic, og chondrogenic slægter. Efter 14 dage af differentiering, bestemt pletter blev udnyttet til at opdage lipid ophobning i adipocytter (olie røde O), forkalkede indlån i osteogenic celler (Alizarin rød), eller glycosaminoglycans og kollagen i chondrogenic celler (Masson’s Trichrome). Mens knoglemarv MSC effektivt differentieret i alle tre slægter, PVAT-afledte celler havde adipogenic og chondrogenic potentiale, men manglede robust osteogenic potentiale.
Introduction
Fedtvæv er en rig kilde af multi potent mesenchymale stamceller (MSC) i stand til at differentiere i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic lineages1. Dette væv udvider gennem hypertrofi af modne adipocytter og de novo differentiering af hjemmehørende MSC til adipocytter. Perivascular fedtvæv (PVAT) omgiver blodkar og regulerer vaskulære funktion2,3. Fedme-induceret PVAT ekspansion forværrer hjerte-kar-sygdomme. Mens den Multipotente potentiale af MSC fra menneskelige subcutan fedt depoter er blevet godt undersøgt4,5, har ingen undersøgelser eksplanterede og evalueret differentiering kapaciteten af menneskelige PVAT-afledte stamceller, sandsynligvis skyldes invasionsevne af indkøb. Målet med dette arbejde er således, at fremlægge en metodologi til explant og udbrede stamceller fra menneskelige aorta PVAT fra patienter med hjerte-kar-sygdom og til at teste deres tilbøjelighed til at differentiere til osteogenic, chondrogenic og adipogenic slægter. Vores PVAT er fra stedet, hvor anastomose af bypass graft på opstigende aorta af overvægtige patienter, der gennemgår koronararterie bypass graft operation. Frisk isoleret PVAT er enzymatisk adskilles og stromale vaskulære brøken er isoleret og opformeret in vitro, gør det muligt for os at teste for første gang differentiering kapaciteten af menneskelige PVAT-afledte stamceller.
Hjælp af primære kulturperler menneskelige PVAT stromale vaskulære brøkdel, testede vi tre assays designet til at fremkalde stem/stamceller til at differentiere mod adipogenic, osteogenic, eller chondrogenic slægter. Vores forudgående undersøgelse identificeret en befolkning på CD73 +, CD105 + og PDGFRa + (CD140a) celler, der kan håndfast differentiere i adipocytter6, selv om deres multipotency ikke var testet. PVAT regulerer direkte vaskulære tone og betændelse7. Begrundelsen for afprøvning differentiering potentialet i denne roman celle population er at begynde at forstå den specialiserede indflydelse af PVAT på vaskulære funktion, og mekanismer for PVAT ekspansion under fedme. Denne metode øger vores forståelse af funktionerne af fedtvæv afledte stamceller og gør det muligt for os at identificere og sammenligne ligheder og forskelle af stamceller fra forskellige væv kilder. Vi bygge på etablerede og validerede metoder til isolering og differentiere MSC mod forskellige slægter og optimere procedurerne for at maksimere levedygtigheden af menneskelige PVAT-afledte stamceller. Disse teknikker har brede anvendelsesmuligheder inden for stilk og stamfader celle forskning og fedtvæv udvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipøst stamceller fra forskellige depoter varierer meget i fænotype og differentiering potentielle9. Dyrkning af PVAT-afledt ophav fra en enkelt patient donor i samtidige induktion ned tre forskellige slægter, adipogenic, osteogenic, og chondrogenic, giver mulighed for et godt kontrolleret undersøgelse af pluripotente kapacitet af denne roman befolkningen i stamceller. Den metode, der er beskrevet i denne rapport kan bruges til at teste differentiering kapaciteten af stamceller fra menneskeli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender assistance forskning navigation på Maine Medical Center for at hjælpe med indkøb af kliniske væv, og histopatologi og histomorfometri Core (støttet af 1P20GM121301, L. Liaw PI) på Maine Medical Center forskning Institut for skæring og farvning. Dette arbejde blev støttet af NIH give R01 HL141149 (L. Liaw).
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
References
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
- Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
- de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
- Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
- Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
- Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
- Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
