Capacité de différenciation des cellules souches humaines aortiques périvasculaires adipeux
Summary
Ce protocole vise à tester la capacité des cellules souches dérivées du tissu adipeux humain périvasculaire se différencier en plusieurs lignées cellulaires. La différenciation a été comparée à des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine, qui est appelée à se différencier en adipocytes et ostéocytaires chondrocyte lignées.
Abstract
Le tissu adipeux est une source riche de multiples puissantes cellules souches mésenchymateuses (CSM) capables de différencier dans ostéogénique, adipocytaire, lignées chondrogéniques et. La différenciation adipocytaire de cellules progénitrices est un mécanisme important de conduire l’expansion du tissu adipeux et la dysfonction en réponse à l’obésité. Modifications de compréhension pour le tissu adipeux périvasculaires (TVAP) est donc cliniquement pertinentes dans les maladies métaboliques. Cependant, des études antérieures ont été principalement effectuée chez la souris et autre animaux modèles. Ce protocole utilise des échantillons TVAP thoraciques humains prélevés sur les patients subissant une coronaropathie pontage aorto-coronarien greffon. Le tissu adipeux de l’aorte ascendante a été collecté et utilisé pour l’explantation de la fraction stroma vasculaire. Nous avons déjà confirmé la présence de cellules progénitrices adipeuse dans TVAP humaine ayant la capacité de se différencier en contenant des lipides adipocytes. Dans cette étude, nous avons analysé plus loin le potentiel de différenciation des cellules de la fraction vasculaire stromale, contenant probablement des cellules progénitrices multi-puissant. Nous avons comparé les cellules TVAP dérivées de la moelle osseuse humaine MSC pour une différenciation adipocytaire, ostéogénique et chondrogéniques lignages. Après 14 jours de la différenciation, des colorants spécifiques ont été utilisés pour détecter l’accumulation de lipides dans les adipocytes (huile rouge O), des dépôts calcifiées en cellules ostéogéniques (alizarine rouge), ou de glycosaminoglycanes et de collagène dans les cellules chondrogéniques (Trichrome de Masson). Alors que la moelle osseuse MSC distingue efficacement tous les trois lignées, cellules dérivées de TVAP avaient adipocytaire et chondrogéniques potentielle, mais n’avait pas de potentiel ostéogénique robuste.
Introduction
Le tissu adipeux est une source riche de multiples puissantes cellules souches mésenchymateuses (CSM) capables de différencier dans ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques lignages1. Ce tissu se développe à travers une hypertrophie des adipocytes matures et de différenciation de novo du SMC résident aux adipocytes. Le tissu adipeux périvasculaires (TVAP) entoure les vaisseaux sanguins et régule la fonction vasculaire2,3. Expansion de TVAP induites par l’obésité aggrave des pathologies cardiovasculaires. Alors que le potentiel multipotent du SMC de dépôts adipeux sous-cutané humaines ont été bien étudié4,5, aucune étude ont explantées et évalué la capacité de différenciation des humains dérivés TVAP progénitrices, probables due à le pouvoir envahissant des marchés. Ainsi, l’objectif de ce travail est de fournir une méthodologie d’explantation et propager des cellules progénitrices de humaine TVAP aortique chez les patients atteints de maladies cardiovasculaires et de tester leur propension à se différencier à ostéogénique, chondrogéniques et adipocytaire lignées. Notre source de TVAP est sur le site de l’anastomose de la greffe de pontage sur l’aorte des patients obèses devant subir une chirurgie de greffe pontage artère coronaire ascendante. TVAP fraîchement isolées est enzymatiquement dissociées et la fraction stroma vasculaire est isolée et propagée in vitro, ce qui nous permet de tester pour la première fois la capacité de différenciation des cellules progénitrices de dérivés de TVAP humaine.
Utilisant primaire culture humaine TVAP stroma vasculaire fraction, nous avons testé trois tests conçus pour induire les cellules souches/progénitrices vers adipocytaire, ostéogénique, ou chondrogéniques lignages. Notre étude préalable identifié une population de CD73 +, CD105 + et PDGFRa + (CD140a) des cellules qui peuvent se différencier robuste en adipocytes6, bien que leur multipotentialité n’a pas été testée. TVAP régule directement de ton et l’inflammation vasculaire7. La raison d’être pour tester le potentiel de différenciation de cette population de cellules nouvelles doit commencer à comprendre l’influence spécialisé de TVAP sur la fonction vasculaire et les mécanismes d’expansion TVAP au cours de l’obésité. Cette méthode améliore notre compréhension des fonctions des cellules progénitrices dérivées de tissus adipeux et nous permet d’identifier et de comparer les similitudes et les différences des cellules progénitrices de sources de tissus différents. Nous inspirer des approches établies et validées pour isoler et de différencier les MSC vers différentes lignées et optimiser les procédures afin de maximiser la viabilité de cellules progénitrices de dérivés de TVAP humaine. Ces techniques ont des applications larges dans le domaine des souches et progénitrices cellule recherche et le tissu adipeux de développement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipeuse progéniteurs de différents dépôts varient largement en phénotype et différenciation potentiels9. Culture des progéniteurs TVAP dérivés provenant d’un donneur unique patient à induction simultanée vers le bas de trois lignées différentes, adipocytaire, ostéogénique et chondrogéniques, permet une étude bien contrôlée des capacités pluripotentes de ce roman population de cellules progénitrices. La méthodologie décrite dans le présent rapport peut être utilisée pou…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons l’aide de la Navigation de recherche au centre médical de Maine pour aider avec l’achat de tissus cliniques et l’histopathologie et Histomorphométrie Core (pris en charge par 1P20GM121301, L. Leblanc PI) au Maine Medical Research Center Institut de coupes et de coloration. Ce travail a été soutenu par les NIH accorder R01 HL141149 (L. Leblanc).
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
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