Differenzierung-Kapazität des menschlichen Aortenklappe perivaskuläre Fettgewebe Vorläuferzellen
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist, die Fähigkeit der Vorläuferzellen aus menschlichen perivaskuläre Fettgewebe abgeleitet, in mehrere Linien der Zelle differenzieren zu testen. Differenzierung war im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen Knochenmark, die bekanntlich in Adipocyte, Osteocyte und Knorpelzelltransplantation Abstammungen zu differenzieren.
Abstract
Fettgewebe ist eine reiche Quelle von Multi-potenten mesenchymalen Stammzellen (MSC) in der Lage, Differenzierung in osteogene, adipogenen und Chondrogenic Linien. Adipogenen Differenzierung der Progenitorzellen ist ein wichtiger Mechanismus fahren Fettgewebe Expansion und Dysfunktion als Reaktion auf Adipositas. Verständnis Änderungen perivaskuläre Fettgewebe (PVAT) ist somit klinisch relevante in Stoffwechselerkrankung. Frühere Studien wurden jedoch überwiegend in der Maus und anderen Tieren durchgeführt Modelle. Dieses Protokoll verwendet humanen thorakale PVAT Proben von Patienten mit koronarer Bypassoperation Transplantat gesammelt. Fettgewebe aus der Aorta ascendens wurde gesammelt und verwendet für die Explantation der Stromazellen vaskulären Bruch. Wir zuvor bestätigt das Vorhandensein von adipösen Vorläuferzellen in menschlichen PVAT mit der Fähigkeit, sich in Lipid-haltigen differenzieren Adipozyten. In dieser Studie analysierten wir weiter die Differenzierung Potential der Zellen von den Stromazellen vaskulären Bruch, vermutlich mit Multi-potenten Vorläuferzellen. Wir verglichen PVAT gewonnenen Zellen menschlichen Knochenmark MSC für Unterscheidung in adipogenen, osteogene, und Chondrogenic Linien. Nach 14 Tagen der Differenzierung, bestimmte Flecken waren ausgelastet, um Lipid-Akkumulation in Adipozyten (Öl rot O), zu erkennen Schulterarthrose Ablagerungen in knochenbildenden Zellen (Alizarin rot) oder Glykosaminoglykane und Kollagen in den Chondrogenic Zellen (Masson Trichrome). Während des Knochenmarks MSC effizient in allen drei Linien differenziert, PVAT abgeleitete Zellen hatten adipogenen und Chondrogenic Potenzial, aber es fehlte ihm robuste osteogene Potenzial.
Introduction
Fettgewebe ist eine reiche Quelle von Multi-potenten mesenchymalen Stammzellen (MSC) in der Lage, Differenzierung in osteogene, adipogenen und Chondrogenic Linien1. Dieses Gewebe wird erweitert durch Hypertrophie der Reifen Adipozyten und de Novo Differenzierung von resident MSC zu Adipozyten. Perivaskuläre Fettgewebe (PVAT) umgibt den Blutgefäßen und regelt die Gefäßfunktion2,3. Adipositas-induzierte PVAT Erweiterung verschärft die Herz-Kreislauf-Krankheiten. Während der multipotente Potenzial von MSC aus menschlichen Subkutane Fettgewebe-Depots wurden gut untersuchte4,5, haben keine Studien explantiert und bewertet die Differenzierung Kapazität des menschlichen PVAT abgeleitet Vorläuferzellen, wahrscheinlich aufgrund die Invasivität der Beschaffung. Ziel dieser Arbeit ist es daher, liefern eine Methodik um explant und Vorläuferzellen aus menschlichen Aortenklappe PVAT von Patienten mit einer kardiovaskulären Erkrankung zu verbreiten und ihre Neigung zu knochenbildenden unterscheiden, Chondrogenic und adipogenen Linien zu testen. Unsere PVAT ist von der Website der Anastomose der Bypass-Prothese auf aufsteigende Aorta von adipösen Patienten mit koronarer Bypassoperation Transplantat. Frisch isolierte PVAT wird enzymatisch dissoziierten und Stromazellen vaskuläre Bruch ist isoliert und propagiert in-vitro-, ermöglicht uns, zum ersten Mal die Differenzierung Kapazität des menschlichen PVAT abgeleitet Vorläuferzellen zu testen.
Mit primären kultivierten menschlichen PVAT Stromazellen vaskulären Bruchteil, testeten wir drei Assays entwickelt, um Stammzellen/Vorläuferzellen in Richtung adipogenen, osteogene, oder Chondrogenic Linien unterscheiden zu induzieren. Unsere vorherige Studie identifiziert eine Bevölkerung von CD73 + CD105 + und PDGFRa + (CD140a) Zellen, die robust in Adipozyten6, differenzieren können, obwohl ihre Multipotenz nicht getestet wurde. PVAT regelt direkt vaskulären Ton und Entzündungen7. Die Begründung für die Prüfung der Differenzierung Potenzial dieser neuartigen Zellpopulation ist zu beginnen, der spezialisierten Einfluss der PVAT auf Gefäßfunktion und Mechanismen der PVAT Expansion während Fettleibigkeit zu verstehen. Diese Methode erhöht unser Verständnis der Funktionen von Fettgewebe abgeleitete Vorläuferzellen und ermöglicht es uns, zu identifizieren und vergleichen Sie Gemeinsamkeiten und Unterschiede der Vorläuferzellen aus verschiedenen Gewebe Quellen. Wir bauen auf etablierte und validierten Ansätze zum isolieren und Differenzierung von MSC auf verschiedenen Linien und optimieren Verfahren um die Lebensfähigkeit des menschlichen PVAT abgeleitet Vorläuferzellen zu maximieren. Diese Techniken haben breite Anwendungen in den Bereichen von Stamm- und Vorläuferzellen Zelle Forschung und Fettgewebe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipöse Vorläuferzellen aus verschiedenen Depots unterschiedlich in Phänotyp und Differenzierung möglicher9. Kultivierung PVAT stammenden Vorfahren von einem einzigen Patienten Spender in gleichzeitige Induktion auf drei verschiedenen Linien, ermöglicht adipogenen, osteogene, und Chondrogenic, eine kontrollierte Untersuchung der pluripotenten Kapazität dieses Romans Bevölkerung von Vorläuferzellen. In diesem Bericht beschriebene Methode kann die Kapazität der Differenzierung Vorläuferzel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir anerkennen die Unterstützung der Forschung Navigation am Maine Medical Center für die Unterstützung bei der Beschaffung von klinischen Gewebe und der Histopathologie und Histomorphometrie Kern (unterstützt von 1P20GM121301, L. Liaw PI) bei Maine Medical Center Research Institut für schneiden und färben. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R01 HL141149 zu gewähren (L. Liaw).
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
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