Capacità di differenziazione delle cellule progenitrici umane aortica perivascolare adiposo
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è quello di testare la capacità di cellule progenitrici derivate dal tessuto adiposo umano perivascolare di differenziarsi in stirpi multipli delle cellule. La differenziazione è stata confrontata alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano, che è noto per differenziare in adipociti, Osteocita e lignaggi di condrociti.
Abstract
Il tessuto adiposo è una ricca fonte di multi-potente cellule staminali mesenchimali (MSC) in grado di differenziarsi in osteogenica, adipogenico e condrogenica lignaggi. Adipogenico differenziazione delle cellule progenitrici è un meccanismo importante che guida l’espansione del tessuto adiposo e disfunzione in risposta all’obesità. Capire i cambiamenti al tessuto adiposo perivascolare (PVAT) così è clinicamente rilevanti nella malattia metabolica. Tuttavia, gli studi precedenti sono stati prevalentemente eseguiti in altri animali e il mouse modelli. Questo protocollo utilizza campioni a PVAT toracici umani raccolti da pazienti sottoposti a chirurgia dell’innesto di bypass coronarico. Tessuto adiposo dall’aorta ascendente è stato raccolte e utilizzato per espianto della frazione vascolare stromal. Abbiamo precedentemente confermato la presenza di cellule progenitrici adipose in PVAT umano con la capacità di differenziarsi in contenenti lipidi adipociti. In questo studio, abbiamo analizzato ulteriormente il potenziale di differenziazione delle cellule dalla frazione vascolare stromal, presumibilmente contenente cellule progenitrici multi-potente. Abbiamo confrontato le cellule derivate da PVAT al midollo osseo umano MSC per differenziazione in adipogenico, osteogenica e condrogenica lignaggi. Dopo 14 giorni di differenziazione, macchie specifiche sono state utilizzate per rilevare l’accumulo di lipidi negli adipociti (O olio rosso), i depositi calcificanti in cellule osteogeniche (Alizarin Red.), o di glicosaminoglicani e di collagene nelle cellule condrogenica (Trichrome di Masson). Mentre midollo osseo MSC differenziate in modo efficiente in tutti e tre i stirpi, cellule derivate da PVAT avevano adipogenico e condrogenica potenziale, ma mancava il potenziale osteogenico robusto.
Introduction
Il tessuto adiposo è una ricca fonte di multi-potente cellule staminali mesenchimali (MSC) in grado di differenziarsi in osteogenica, adipogenico e condrogenica lignaggi1. Questo tessuto si espande attraverso l’ipertrofia dei adipocytes maturi e de novo differenziazione delle MSC residente ai adipocytes. Tessuto adiposo perivascolare (PVAT) circonda i vasi sanguigni e regola la funzione vascolare2,3. Espansione di PVAT indotta da obesità aggrava patologie cardiovascolari. Mentre il potenziale multipotente di MSC da depositi adiposi sottocutanei umani sono stati ben studiato4,5, nessuno studio hanno espiantati e valutate la capacità di differenziazione delle cellule progenitrici PVAT-derivati umani, probabile causa di l’invasività degli appalti. Così, l’obiettivo di questo lavoro è fornire una metodologia per explant e propagare cellule progenitrici da umano PVAT aortica da pazienti con malattie cardiovascolari e per testare la loro propensione a differenziare a osteogenica, condrogenica e adipogenico lignaggi. La nostra fonte di PVAT è dal sito dell’anastomosi dell’innesto del bypass su aorta di pazienti obesi sottoposti a chirurgia dell’innesto di bypass coronarico ascendente. PVAT appena isolato è enzimaticamente-dissociata e la frazione vascolare stromal è isolata e propagata in vitro, che ci permette di testare per la prima volta la capacità di differenziazione delle cellule progenitrici PVAT-derivati umani.
Utilizzando primaria coltura umana PVAT stromal frazione vascolare, abbiamo testato tre saggi progettati per indurre le cellule staminali/progenitrici a differenziarsi verso adipogenico, osteogenica, o condrogenica lignaggi. Il nostro studio precedente identificato una popolazione di CD73 +, CD105 + e cellule PDGFRa + (CD140a) che robustamente possono differenziare in adipociti6, anche se non è stata testata loro multipotenza. PVAT regola direttamente il tono e l’infiammazione vascolare7. La spiegazione razionale per testare il potenziale di differenziazione di questa popolazione cellulare romanzo è cominciare a comprendere l’influenza specializzato di PVAT sulla funzione vascolare e meccanismi di espansione di PVAT durante l’obesità. Questa metodologia migliora la nostra comprensione delle funzioni di cellule progenitrici derivate del tessuto adiposo e ci permette di identificare e confrontare le somiglianze e le differenze delle cellule progenitrici da fonti differenti del tessuto. Costruiamo su approcci stabiliti e convalidati per isolare e differenziare MSC verso diversi lignaggi e ottimizzare le procedure per massimizzare la vitalità delle cellule progenitrici PVAT-derivati umani. Queste tecniche hanno vaste applicazioni nei settori di sviluppo del tessuto adiposo e ricerca delle cellule staminali e progenitrici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellule progenitrici adipose da depositi differenti variano ampiamente nel fenotipo e differenziazione potenziali9. Coltura progenitori PVAT-derivati da un singolo donatore paziente in simultanea induzione giù tre stirpi differenti, adipogenico, osteogenica e condrogenica, permette un’indagine ben controllata della capacità pluripotenti di questo romanzo popolazione di cellule progenitrici. La metodologia descritta in questo rapporto può essere utilizzata per verificare la capacità di differen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo l’assistenza di ricerca navigazione a Maine Medical Center per assistere l’assicurato nella ricerca del tessuto clinico, istopatologia e istomorfometria Core (supportato da 1P20GM121301, L. Liaw PI) a Maine Medical Center Research Istituto per sezionamento e colorazione. Questo lavoro è stato supportato da NIH concedere HL141149 R01 (Liaw L.).
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
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