Differentiering kapacitet av mänskliga aorta perivaskulär Adipose stamceller
Summary
Målet med detta protokoll är att testa stamceller som härrör från mänskliga perivaskulär fettvävnad förmåga att differentieras till flera cell härstamningar. Differentiering jämfördes mesenkymala stamceller som härrör från human benmärg, som är känd att differentieras till fettceller, osteocyte och chondrocyte härstamningar.
Abstract
Fettväv är en rik källa av flera potenta mesenkymala stamceller (MSC) kan differentiera till osteogent, adipogena, och chondrogenic härstamningar. Adipogena differentiering av stamceller är en viktig mekanism körning adipose vävnadsexpansion och dysfunktion i svar till fetma. Förståelse ändringar perivaskulär fettvävnad (PVAT) är alltså kliniskt relevanta i metabola sjukdomar. Tidigare studier har dock huvudsakligen utförs i musen och andra djur modeller. Detta protokoll använder mänskliga bröstkorg PVAT prover som samlats in från patienter som genomgick koronar bypass kirurgi. Fettvävnad från aorta ascendens var samlas och används för explantation av stromal vaskulär fraktionen. Vi tidigare bekräftat förekomsten av fett stamceller i mänskliga PVAT med förmåga att differentieras till lipid-innehållande adipocyter. I denna studie analyserade vi ytterligare differentiering potential celler från den stromal vaskulära fraktionen, som förmodligen innehåller flera potenta stamceller. Vi jämförde PVAT-derived celler till mänsklig benmärg MSC för differentiering in adipogena, osteogena, och chondrogenic härstamningar. Efter 14 dagar av differentiering, utnyttjades specifika fläckar för att upptäcka lipid ackumulering i adipocyter (olja röd O), förkalkade inlåning i osteogena celler (Alizarin Red), eller glykosaminoglykaner och kollagen i chondrogenic celler (Masson’s Trichrome). Samtidigt benmärg MSC effektivt differentieras efter alla tre härstamningar, PVAT-derived celler hade adipogena och chondrogenic potentiella, men saknade robust osteogent potential.
Introduction
Fettväv är en rik källa av flera potenta mesenkymala stamceller (MSC) kan differentiera till osteogent, adipogena, och chondrogenic härstamningar1. Denna vävnad expanderar genom hypertrofi av mogen adipocyter och de novo differentiering av bosatta MSC till adipocyter. Perivaskulär fettväv (PVAT) omger blodkärl och reglerar vaskulär funktion2,3. Fetma-inducerad PVAT expansion förvärrar kardiovaskulära patologier. Medan Multipotenta potentialen hos MSC från mänskliga subkutana fett depåer har varit studerade4,5, har inga studier explanterad och utvärderas differentiering kapaciteten av mänsklig PVAT-derived stamceller, sannolikt på grund invasivitet av upphandling. Målet med detta arbete är således att tillhandahålla metoder att explant och propagera stamceller från mänskliga aorta PVAT från patienter med hjärtkärlsjukdom och testa deras benägenhet att differentiera till osteogent, chondrogenic och adipogena härstamningar. Våra PVAT kommer från platsen för anastomos av bypass transplantat på stigande aorta av överviktiga patienter som genomgick koronar bypass kirurgi. Färsk-isolerad PVAT är enzymatiskt-differentierade och stromal vaskulär fraktionen är isolerade och förökade in vitro gör det möjligt för oss att testa för första gången differentiering kapaciteten av mänsklig PVAT-derived stamceller.
Med primära odlade mänskliga PVAT stromal vaskulär bråkdel, testade vi tre analyser för att inducera stamceller/stamceller att differentiera mot adipogena, osteogena, eller chondrogenic härstamningar. Vår tidigare studie identifierat en befolkning på CD73 +, CD105 + och PDGFRa + (CD140a)-celler som kraftfullt kan skilja i adipocyter6, även om deras multipotency inte testades. PVAT reglerar direkt vaskulär tonen och inflammation7. Grunden för testning differentiering potentialen i denna roman cell befolkningen är att börja förstå specialiserade påverkan av PVAT på vaskulär funktion och mekanismer för PVAT expansion under fetma. Denna metod ökar vår förståelse för funktionerna av fettvävnad härledda stamceller och gör det möjligt för oss att identifiera och jämföra likheter och skillnader av stamceller från olika vävnad källor. Vi bygger på etablerade och validerade metoder för isolering och differentiera MSC mot olika härstamningar och optimera procedurer för att maximera lönsamheten för mänskliga PVAT-derived stamceller. Dessa tekniker har bred applikationer i fälten av stammen och progenitor cell forskning och fettvävnad utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fett stamceller från olika depåer varierar kraftigt i fenotyp och differentiering potentiella9. Odling PVAT-derived stamfäder från en enda patient donator i samtidiga induktion ner tre olika härstamningar, möjliggör adipogena, osteogena, och chondrogenic, en väl kontrollerad undersökning av denna roman pluripotenta kapacitet befolkningen av stamceller. Den metod som beskrivs i denna rapport kan användas för att testa kapaciteten differentiering av stamceller från mänskliga PVAT och f?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner stöd av forskning navigering på Maine Medical Center för att bistå med upphandling av kliniska vävnad, och histopatologi och Histomorphometry kärna (stöds av 1P20GM121301, L. Liaw PI) på Maine Medical Center forskning Institutet för snittning och färgning. Detta arbete stöds av NIH bevilja R01 HL141149 (L. Liaw).
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
References
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
- Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
- de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
- Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
- Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
- Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
- Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
