Un’istruzione dettagliata è descritta su come costruire un altamente propenso spazzato tile (HIST) microscopio e suo utilizzo per l’imaging di singola molecola.
Formazione immagine singola molecola ha notevolmente avanzato la nostra comprensione dei meccanismi molecolari in studi biologici. Tuttavia, è stato impegnativo per ottenere immagini di grandi dimensioni campo di vista, ad alto contrasto in spessore cellule e tessuti. Qui, presentiamo la microscopia tegola Sweep altamente inclinata (HIST) che supera questo problema. Un paio di lenti cilindriche è stato implementato per generare un fascio di eccitazione allungata che è stato digitalizzato su una vasta area di imaging tramite uno specchio galvo veloce. Per posizionare i componenti ottici è stata utilizzata una configurazione di 4f . Una fotocamera scientifiche complementari metal-oxide semiconductor rilevato il segnale di fluorescenza e bloccato sullo sfondo di out-of-focus con una fessura confocale dinamica sincronizzata con la pulizia del fascio. Vi presentiamo un istruzioni dettagliate sulla costruzione del microscopio HIST con tutti i componenti di base.
L’imaging di fluorescenza di singola molecola svolge un ruolo importante in molti studi biologici che rivelano ultrastrutture, la dinamica e la quantità di biomolecole1,2,3. Tuttavia, esso è stato impegnativo per studiare singolo-molecole all’interno di cellule o tessuti. Mentre la microscopia confocale fornisce alta taglio capacità4, non è adatto per l’imaging di singola molecola a causa di grave photobleaching dall’intensità di eccitazione ad alta o bassa velocità di formazione immagine. Widefield microscopia utilizza più debole illuminazione ma soffre di un segnale è scarso a sfondo rapporto (SBR)5. Microscopia a luce-foglio d’altra parte, potrebbe mostrare buona sezionamento e photobleaching basso6; Tuttavia, il disponibile apertura numerica (NA) è notevolmente limitata dal requisito di obiettivi posizionati ortogonalmente7. In alternativa, richiede speciali illuminatori e campione Colombo8,9.
Per questi motivi, la microscopia foglio ottico altamente propensa e laminato (HILO) è stato ampiamente usata per 3D imaging di singola molecola10. Quando un fascio di luce inclinato rileva un’interfaccia di due mezzi (vetro e acqua, per esempio), il fascio viene rifratta secondo la legge di Snell. D’importanza, il raggio rifratto si assottiglia, ed il suo spessore è descritto come dz = R/tan(θ) dove R è il diametro del fascio inclinato e θ è l’angolo di rifrazione del raggio trasmesso. Questa implementazione semplice si traduce in una buona capacità di taglio. Tuttavia, questo rapporto indica che una sottile illuminazione (cioè, elevata capacità di taglio) richiede una piccola R e/o un grande θ. Ad esempio, quando R = 20 µm e θ = 72 gradi, uno può ottenere dz = 6,5 µm. Poiché non esiste un limite pratico per aumentare l’angolo di rifrazione per immagine profonda all’interno delle cellule ed evitare riflessione interna totale, c’è un forte accoppiamento del illuminazione diametro e lo spessore del fascio. Per questo motivo, HILO imaging mostra un relativamente piccolo campo di vista (FOV) che limita notevolmente le sue applicazioni in imaging pluricellulari.
Recentemente, abbiamo superato questo problema da microscopia tegola Sweep altamente inclinata (HIST) dove il FOV è disaccoppiato dallo spessore del fascio in un modo molto semplice11. In primo luogo, un fascio di forma allungato in una direzione è generato tramite una coppia di lenti cilindriche. Questa trave, definita come una tegola, produce un’illuminazione sottile con dz ~ 4 µm mentre suo FOV è 130 x 12 µm2. Quindi, la piastrella è spazzata tutta l’esempio utilizzando uno specchio rotante galvo. Nel frattempo, l’immagine di fluorescenza è registrata su una videocamera scientifiche complementari metal-oxide semiconductor (sCMOS) che filtra in modo efficiente di out-of-focus sfondo operando in una modalità dell’otturatore rolling che serve come rilevamento sintonizzabile fessura confocale. In questo modo, HIST microscopia permette l’imaging a singola molecola con un campo visivo più grande (~ 130 x 130 µm2) e un’illuminazione più sottile rispetto all’imaging di HILO. Abbiamo applicato questa nuova tecnica per rilevare le trascrizioni del RNA con una singola sonda in cellule o con alcune sonde nei tessuti di cervello di topo, che ha un potenziale significativo per lo studio delle malattie e l’espressione genica di imaging. A differenza di altri approcci, HIST impiega solo un obiettivo singolo apertura numerica elevata senza un illuminatore aggiuntivo o obiettivi di rilevamento remoto ed è pienamente compatibile con microscopi rovesciati. Questi vantaggi insieme un grande FOV e ad alto contrasto farà HIST microscopia uno strumento importante nella biologia e nella medicina. Vi presentiamo le istruzioni dettagliate per quanto riguarda la strumentazione del microscopio HIST e come testare e calibrare la sua prestazione come qui sotto.
Ci sono due passaggi critici in questo protocollo. Il primo è il posizionamento corretto di L4 al punto 3.3, assicurando che il fascio incidente passa attraverso il centro della lente e un modello di disco di Airy perfetto è formato sul soffitto. La posizione di L4 determina la posizione di tutti gli altri componenti ottici, tra cui M5, L3, GM e L2. Il secondo passaggio critico è il processo di sincronizzazione. Per rifiutare il out sfondo sfocato, pixel attivi cui larghezza efficace rilevamento è uguale alla larghezza della piastrella deve essere sincronizzato con la pulizia del fascio. Pertanto, è necessario misurare la larghezza efficace illuminazione di un fascio di mattonelle (punto 5.6) e impostare la fotocamera parametri conseguenza al punto 6.4.
Quando la formazione immagine con FOV molto grande, il metodo presentato Mostra un aumento sfondo su un lato rispetto a altro lato. Ciò è attribuita agli angoli leggermente alterati dell’illuminazione alle diverse posizioni di imaging. Implementazione di un secondo specchio galvo invece M5 allevia questo problema come dimostrato prima regolando in modo sincrono la posizione e la scansione angolo11. Invece di doppietti acromatici disponibili in commercio, obiettivo telecentrico scansione sarà anche utile. Tuttavia, per l’imaging di un’area di < 8.080 µm2, galvo singolo specchio spazzamento era sufficiente. HIST microscopia ha un limite di profondità imaging, tuttavia, è in grado di ottenere un buon SBR quando fino a ~ 15 µm con un fascio di mattonelle di 12 µm e un NA 1,45 olio immersione dell’obiettivo11di imaging.
In questo protocollo, abbiamo usato un rapporto di compressione del fascio di 8 per fare un fascio di piastrelle. Un’illuminazione più sottile può essere utilizzatoin HIST microscopia per raggiungere SBR superiore, che potrebbe essere potente per11di formazione immagine del tessuto di singola molecola. Tuttavia, in questo caso, photobleaching effetto dovrebbe essere considerato da un’intensità maggiore eccitazione mentre il rapporto di compressione di fascio attuale ha mostrato ridotta photobleaching in imaging 3D rispetto al Epi11. Rispetto ai microscopi di luce-foglio con due obiettivi posizionati ortogonalmente, HIST microscopia è semplice da implementare e compatibile con preparazione del campione convenzionale. L’avanzata SBR e grande FOV di HIST microscopia è adatto per studiare le interazioni e le dinamiche delle singole biomolecole in più celle e può essere utilizzato ulteriormente in Super-resolution imaging e rilevamento di singola molecola.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (HR00111720066) e la National Science Foundation (NSF) (1805200). Ringraziamo Michael Serge nella tecnologia di Andor per generosamente prestato la macchina fotografica di sCMOS.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |