Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme
Summary
Bu protokolü nasıl görüntü yaşamak ve sürgün apikal sürgen confocal mikroskobu tarama lazer kullanarak farklı bitki türü üzerinden analiz sunuyor.
Abstract
Sürgün apikal meristem (SAM) işlevleri korunmuş kök hücre rezervuar ve olarak postembryonic geliştirme sırasında hemen hemen tüm yerüstü dokular oluşturur. Etkinlik ve SAMs Morfoloji çekim mimarisi, boyutu ve üreme organları ve en önemlisi, tahıl verim sayısı gibi önemli tarımsal özellikleri belirler. Burada, biz yüzey morfolojisi ve iç hücresel yapısı farklı türlerden yaşam SAMs confocal mikroskobu tarama lazer ile analiz etmek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) görüntüleri edinimi için numune hazırlama üzerinden tüm prosedürü içinde gerçekleştirilebilir 20 dakika gibi kısa. Bu iletişim kuralı sadece önümüzdeki eğitim kuruluşu ve gelişimi için basit ama güçlü bir araç sağlayarak SAMs modeli tür aynı zamanda farklı bitkileri, bitkisel sürgen eğitimi için yüksek verimli olduğunu ispat sürgen farklı bitki türleri arasında.
Introduction
Bitki meristem bir havuzu farklılaşmamış kök hücre içeren ve sürekli olarak bitki organ büyüme ve gelişme1ayakta tutan. Postembryonic geliştirme sırasında hemen hemen tüm yerüstü dokular bir bitkinin sürgün apikal meristem (SAM) türetilir. Bitkileri, etkinlik ve SAM ve onun türetilmiş çiçek sürgen boyutunu sıkıca vur mimarisi, meyve üretimi ve tohum verimi gibi birçok tarımsal özellikleri ile ilişkilidir. Örneğin, domates, ateş ve önümüzdeki dallanma artış ve böylece ilave çiçek ve meyve organları2üreten sonuçlarındaki genişlemiş bir SAM neden olur. Mısır, SAM boyutunda bir artış daha yüksek tohum sayısı ve toplam verim3,4yol açar. Soya, meristem belirsizlik da ateş mimarisi ile yakından ilişkilidir ve5verim.
Morfolojisi ve anatomisi SAMs ikisi de büyük ölçüde sağlayarak meristem araştırma gelişti histolojik kesit/boyama ve elektron mikroskobu (SEM)6, tarama dahil olmak üzere birkaç farklı yöntem tarafından karakterize edilebilir kesit görünümü veya üç boyutlu (3D) yüzey görünümü SAMs. Ancak, her iki yöntem de zaman alıcı, veri toplama, numune hazırlama birkaç deneysel adımlar içeren ve bu yöntemleri esas olarak sabit örnekleri üzerinde bağlıdır. Lazer confocal mikroskobu tekniği tarama son gelişmeler bu sınırlamalarının üstesinden gelir ve bizi hücresel yapısı ve bitki doku ve organların7,8gelişim sürecinin araştırmak için güçlü bir araç sağlar. Aracılığıyla fiziksel doku yerine optik parça, confocal mikroskobu z-yığın görüntüleri bir dizi ve örnek görüntü analiz yazılımı aracılığıyla sonraki 3D inşası topluluğu sağlar.
Burada, biz içinde her ikisi de soruşturma için verimli bir açıklayınız ve farklı yaşam SAMs yüzey yapıları kullanarak potansiyel olarak araştırmacılar tüm deneysel gerçekleştirmek için sağlar confocal mikroskobu tarama lazer tür bitki süreç içinde 20 dakika gibi kısa. Yayınlanan diğer yöntemleri Arabidopsis önümüzdeki SAMs9,10,11,12,13,14canlı confocal görüntüleme için farklı, 15 ve Arabidopsis çiçekler12,13, burada bu protokolü sadece önümüzdeki sürgen modeli tür aynı zamanda bitkisel ateş çalışmak için son derece verimli olduğunu ispat apikal sürgen domates ve soya gibi farklı bitkileri. Bu yöntem üzerinde transgenik floresan işaretleri dayanmaz ve potansiyel olarak çok farklı türler ve çeşitlerin ateş sürgen çalışmaya uygulanabilir. Buna ek olarak, biz de basit görüntü işleme adımları ve 3D görünümünde farklı SAMs çözümlemeyi tanıtmak. Birlikte ele alındığında, bu basit yöntem araştırmacılar canlılar ve bitkiler sürgen gelişimsel süreci ve yapısını daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, meristem düzenleme modeli bitkiler bitkisel ve üreme aşamalarında eğitim için yeni bir cadde açılış sürgün apikal sürgen çalışma odasına küçük değişiklik, farklı bitkilerle uygulanabilir basit bir görüntüleme yöntemi açıklamak ve bitkileri. SEM ve histolojik boyama yöntemleri aksine, bu protokolü yüzey görünümü ve emek yoğun örnek fiksasyon ve/veya doku adımları kesit için gerek kalmadan SAMs iç Hücresel yapıları ortaya çıkarmak yardımcı olabilir. Bu iletişim kura…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Purdue Bindley Bioscience Merkezi tesis Imaging tarama confocal mikroskop lazer erişmek için ve teknik destek için kabul ve yazarlar dan Andy Schaber Purdue Bindley tesiste Imaging yardım için teşekkür ederiz. Bu faaliyet AgSEED Crossroads finansman Indiana’nın tarım ve kırsal kalkınma destek parçası olarak Purdue Üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
References
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Biologie du développement. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
