체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션
Summary
유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
유비퀴틴화는 다양한 신호 경로에서 중요한 역할을 하며 염색질 기능 및 DNA 관련 과정의 조정에 특히 관여하는 번역 후 수정입니다. 이 수정은 E1 유비퀴틴 활성화, E2 유비퀴틴-컨쥬게이팅 및 E3 유비퀴틴-리가제 및 듀비퀴틴-리가제를 포함한 여러 효소의 순차적 작용을 수반하며 듀비퀴틴아제(DUBs)에 의해 역전된다. 유비퀴틴화는 효소 활성의 변조, 단백질-단백질 상호 작용 및 세포외 국소화를 포함한 단백질 기능의 저하 또는 단백질 기능의 변경을 유도합니다. 단백질 유비퀴틴화 또는 듀비퀴틴화를 입증하는 중요한 단계는 정제된 성분으로 시험관 내 반응을 수행하는 것입니다. 효과적인 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응은 사용되는 다양한 성분, 효소 보조 인자, 완충조건 및 기질의 성질에 의해 크게 영향을 받을 수 있다. 여기서는 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 마우스 폴리콤 억압 복합체 1(PRC1), BMI1 및 RING1B, 리신 119에 대한 히스톤 H2A를 모노비퀴틴화하는 E3 유비퀴틴 리가제의 최소한의 성분을 사용하여 이러한 반응을 설명한다. 핵소종 H2A의 듀비퀴틴화는 인간 듀비퀴티나제 BAP1 및 그 보조 인자 ASXL2의 DEUBiquitinase ADaptor(DEUBAD) 도메인에 의해 형성된 최소한의 폴리콤 억압적 듀비퀴타제(PR-DUB) 복합체를 사용하여 수행된다. 이러한 유비퀴틴화/듀비퀴틴화 분석은 포유류 세포로부터 정제된 박테리아 정제 단백질 또는 네이티브 뉴클레오좀으로 재구성된 재조합 뉴클레오좀의 맥락에서 수행될 수 있다. 우리는 이 반응에 중요한 영향을 미칠 수 있는 복잡성을 강조하고 우리는 이 프로토콜의 일반적인 원리가 그밖 E3 유비퀴틴 ligases 및 deubiquitinases에 신속하게 적응될 수 있다는 것을 건의합니다.
Introduction
유비퀴틴화는 번역 후 가장 보존된 변형 중 하나이며 효모, 식물 및 척추동물을 포함한 다양한 유기체에 매우 중요합니다. 유비퀴틴은 단백질을 표적으로 하는 76개의 아미노산 폴리펩티드를 고도로 보존한 유비퀴틴의 공유 부착으로 구성되며, 즉 E1-활성화, E2-컨쥬게이팅 및 E3 리가제1과 관련된 3가지 순차적 단계에서 발생합니다. 2,3. 이 번역 후 수정은 생물학적 과정의 넓은 스펙트럼에서 중심 역할을한다. 실제로 반응의 특이성을 제공하는 E3 ligases는 효소의 큰 슈퍼 패밀리를 구성하며 유비퀴틴 시스템 4,5,6의가장 풍부한 효소입니다. 단백질 유비퀴틴화의 하류 효과는 단핵화, 다중 단핵화, 선형 또는 분기된 폴리유퀴틴화와 같은 변형의 특성에 따라 달라집니다. 단핵화는 거의 프로테아소말 분해와 관련이 없지만, 대신이 수정은 다양한 신호 이벤트를 중재하는 데 관여합니다. 폴리비퀴틴화는 유비퀴틴 분자 자체에서 N 말단 또는 리신 잔기와 관련이 있으며, 폴리유비퀴틴 단백질의 운명은 유비퀴틴 사슬 연장에 관여하는 잔류물에 달려 있습니다. 유비퀴틴의 리신(48)에 의해 매개된 폴리유비퀴틴화는 프로테아소탈화를 유도하는 것으로 오랫동안 알려져 왔다. 반대로, 유비퀴틴의 리신(63)을 통한 폴리유비퀴틴화는 종종단백질 활성화 7,8,9와연관된다. 다른 중요한 번역 후 수정과 유사하게, 유비퀴틴은 가역적이며 단백질에서 유비퀴틴 제거는 세포 과정의 중요한 규제 기관으로 부상한 듀비퀴타제(DUBs)라고 불리는 특정 프로테아제에 의해 보장됩니다. 2개 , 10. 중요한 것은, 많은 DUBs는 고도로 전문화되어 있으며, 단백질 기능에 유비퀴틴화와 듀비퀴틴화 사이의 미세한 균형이 중요하다는 것을 나타내는, 듀비퀴틴화를 통해 조절한다. E3s와 DUBs는 프로테아좀 분해 기계 및 액세서리 요인과 함께 유비퀴틴 프로테아좀 시스템(UPS, >1200 유전자)을 형성하여 세포 성장 및 증식과 관련된 주요 신호 전달 경로를 조절합니다. 세포 운명 결정, 분화, 세포 이동 및 세포 사멸. 중요한 것은, 유비퀴틴화를 수반하는 몇몇 신호 폭포의 규제 완화는 종양발생 및 신경 변성 질환을 촉진5,11,12,13, 14.
유비퀴틴화는 염색질 생물학 및 DNA 의존적 과정에 만연한 역할을 한다15,16,17. 예를 들어, 리신 119(이하 H2A K119ub)에 대한 히스톤 H2A의 단일화는 전사 억압 및 DNA 수리에 관여하는 중요한 번역 후 변형(18,19,20, 21,22. H2A K119ub는 후성 유전학 정보의 유지보수에 중요한 역할을하고 매우 인간에 드로 소필라에서 보존 폴리 콤 억압 단지 1 (PRC1)에 의해 촉매된다. 정식 PRC1은 특히 RING1B 및 BMI1에 의해 구성되며, 이는 전술한 유비퀴틴이벤트(22,23)를담당하는 핵심 E3 유비퀴틴 리가제 복합체이다. Drosophila에서,H2A 단핵화 (H2A K118ub 포유류에서 H2A K119ub에 해당) DUB 칼립소에 의해 반전된다, 이는 폴리 콤 억압 DUB (PR-DUB) 복합체를형성하는 추가 섹스 빗 (ASX)와 상호 작용. 칼립소, BAP1의포유류 직교는 다양한 인간 악성 종양에서 삭제 또는 비활성화된 종양억제제(25,26,27,28, 29세 , 30개 , 31세 , 32세 , 33. BAP1은 핵및 칼슘 신호 매개 세포자멸에서 DNA 의존적 과정을 조절하는 33,34,35,36, 37세 , 38세 , 39세 , 40 , 41세 , 42. BAP1은 특히 ASXL1, ASXL2 및 ASXL3 (ASXL), ASX38,43의3 개의 정형 고리를 포함하는 전사 조절기를 포함하는 다중 소단위 단백질 복합체를 조립한다. ASXL은 BAP1 DUB 활동35,36,44를자극하기 위해 ASXM 도메인이라고도 하는 DEUBiquitinase ADaptor(DEUBAD) 도메인을 사용합니다. 그러므로, ASXL는 염색질에 있는 BAP1 DUB 활동을 조정하고 더 넓게 그것의 종양 억제기 기능에 있는 중요한 역할을 합니다.
유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 과정을 연구하기 위한 몇 가지 방법이 존재한다. 특히, 박테리아에서 정제 된 단백질을 사용하여 생화학 분석은 특정 기질에서 유비퀴틴의 직접 유비퀴틴 또는 제거를 입증하는 데 매우 강력합니다. 이러한 실험은 최소 복합체의 요구 사항 결정, 반응 역학 결정, 구조/기능 관계 정의 및 병리학의 영향 이해와 같은 다양한 매개 변수를 조사하기 위해 수행될 수 있습니다. 유전자 돌연변이. 여기에서, 우리는 정제된 분대를 가진 염색질 기판에 유비퀴틴화 및 deubiquitination 반응을 수행하는 프로토콜을 제공합니다. 모델 시스템으로서, 체외 에서 유비퀴틴화 및 핵소체 H2A 단백질의 듀비퀴틴화가 제시된다. RING1B/BMI1 및 BAP1/DEUBAD의 최소 복합체로 조립된 박테리아 정제 단백질은 각각 뉴클레오소좀 H2A의 유비퀴틴화 또는 듀비퀴틴화에 사용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
관심 있는 단백질에 대 한 강력한 시험관 내 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 어설션을 확립하는 몇 가지 장점이 있습니다. 이러한 분석에 사용할 수 있습니다: (i) 최적의 조건을 설정 하 고 이러한 반응에 대 한 최소한의 요구 사항을 정의, (ii) 효소 운동 및 생 화학 상수를 결정, (iii) 이러한 반응에 영향을 미칠 수 있는 공동 인자 또는 억제제의 역할을 정의, (iv) 상호 작용 인터페이스를 식별, (v) 인공 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
다이애나 아드자우드에게 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (2015-2020), 게놈 퀘벡 (2016-2019) 및 게놈 캐나다 (2016-2019)에서 E.B.A. E.B.B.A.에 대한 보조금에 의해 지원되었다 퐁 드 라 레체 뒤 Québec-Santé의 수석 학자입니다. L.M과 N.S.K.는 FRQ-S에서 박사 학위를 취득했습니다. H.B는 고등 교육부와 튀니지 과학 연구와 콜 재단에서 박사 학위를 받았다.
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
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